Este es el primer informe que demuestra que la inyección intramiocárdica percutánea guiada por ecocardiografía de cardiomiocitos mejora significativamente la propiedad reparadora de los cardiomiocitos humanos derivados de iPS. Este método es un procedimiento factible, satisfactorio, repetible, menos invasivo y efectivo para administrar terapia de cardiomiocitos derivados de iPS humanos. Creemos que la administración intramiocárdica percutánea es un método seguro y eficiente para la administración local de medicamentos para enfermedades como la cardiopatía isquémica, el infarto de miocardio y la insuficiencia cardíaca.
Este proyecto está supervisado por el profesor Jinfu Yang y el profesor Jun Peng. demostrando el procedimiento estarán Xun Wu, Kele Qin y Kun Xiang, MD PhDs de mi laboratorio y Di Wang, PhD del Laboratorio Provincial Provincial Clave de Investigación Cardiovascular de Hunan. Para comenzar, aspirar al vacío el sobrenadante de cultivo de un cultivo de 60 días de hiPSC-CMs.
Lave las celdas con PBS tres veces. Luego disocie los hiPSC-CM en células individuales usando la mezcla de enzimas de desprendimiento celular a 37 grados centígrados durante tres a cinco minutos. Recoja las células en un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de RPMI más B27 medio y mezcle.
Cuente las celdas y calcule el número total de celdas. Centrifugar la suspensión celular a 300G durante dos minutos a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en medio de soporte de cardiomiocitos a una concentración de 6 x 10 de las 4ª células por microlitro.
Coloque el tubo a 37 grados centígrados hasta el paso de inyección. Después de que el ratón esté suficientemente anestesiado, fije las extremidades y la cola con cinta adhesiva. Luego, fije los incisivos del mouse con un hilo de seda 2/0 y cinta adhesiva.
Esterilice el cuello mediano y el pecho izquierdo con tres rondas alternas de betaína seguidas de alcohol. Haga una incisión mediana en el cuello usando tijeras anatómicas finas y pinzas de disección finas. Corte algunos músculos cervicales anteriores para estabilizar y exponer completamente la tráquea.
Inserte una aguja de punción con catéter de calibre 20 como un tubo traqueal a través de la boca. Conecte el tubo traqueal al ventilador y verifique el movimiento torácico para asegurarse de que ambos pulmones estén bien ventilados. Ajuste los parámetros de respiración.
A continuación, vuelva a fijar la extremidad posterior izquierda al lado inferior derecho y afloje la cinta alrededor de la extremidad superior izquierda. Con tijeras y fórceps de disección fina, realice una toracotomía en el espacio intercostal de tres a cuatro del tórax izquierdo. Con fórceps, despegue el pericardio y localice la arteria coronaria descendente anterior izquierda.
Use un hilo de seda 6/0 para ligar el extremo proximal de la arteria. Para asegurarse de que se establece el modelo de infarto agudo de miocardio, espere hasta que el lado distal de la arteria en el sitio de ligadura cambie de rojo a blanco. Cierra el pecho capa por capa y sutura la piel con hilo 4/0.
Para el grupo simulado de animales, realice todos los procedimientos quirúrgicos excepto la ligadura. En las primeras dos semanas después del infarto de miocardio, coloque a los ratones en una caja de anestesia conectada con isofluorano al 5% y realice la intubación traqueal. Tres días antes de administrar hiPSC-CMs, inyecte ciclosporina A en la cavidad intraperitoneal a una dosis de 10 miligramos por kilogramo por día.
Retire el vello del pecho y la parte superior del abdomen del ratón con crema depilatoria. Suministre isofluorano por inhalación hasta que la frecuencia cardíaca se mantenga en 400 a 500 latidos por minuto. Fije las extremidades y la cola del ratón con cinta adhesiva en la consola de detección y ajuste la temperatura de la plataforma a 37 grados centígrados.
Aplique la jalea de ultrasonido en la parte superior del abdomen. Usando una sonda de ultrasonido veterinario de alta resolución, obtenga imágenes de hígado de ratón. Usando una microjeringa de cinco microlitros, extraiga aproximadamente 3 x 10 a los 5º hiPSC-CM.
Sostenga la jeringa e inserte una aguja de tres milímetros en el proceso paraxifoide izquierdo. Bajo la guía de ultrasonido, siga el borde superior del diafragma. Observe el ritmo respiratorio y el rango.
Ingrese al pericardio al final del círculo espiratorio, evitando daños en el hígado y el pulmón. Luego adquiera la imagen paraesternal de eje largo del corazón del ratón mediante ecocardiografía en modo B. Bajo guía ultrasónica, inyecte 1 x 10 a las 5ª células hiPSC-CMs en cada una de las tres áreas marginales del sitio del infarto.
Retire la sonda de ultrasonido y enjuague la gelatina. Destete al ratón de la anestesia y devuélvelo a su jaula. Inyecte ciclosporina A continuamente durante un mes después del trasplante.
El ecocardiograma del ventrículo izquierdo mostró que las lesiones debidas al infarto de miocardio se revirtieron en el grupo de dosis múltiples. El trasplante de hiPSC-CM también dio lugar a un aumento de la fracción de eyección y el acortamiento de la fracción. La medición de los parámetros cardíacos mediante tinción Sirius Red y Fast Green mostró que el tamaño del infarto y la fracción de volumen de colágeno disminuyeron, mientras que el grosor de la pared anterior del ventrículo izquierdo aumentó después del trasplante.
El etiquetado de la alfa actina no específica en verde, DAPI en azul y troponina T específica para humanos en rojo mostró la presencia de células trasplantadas en el infarto y el área marginal del infarto. El número y el porcentaje de células trasplantadas fueron mayores en el grupo de dosis múltiple en comparación con la dosis única. 28 días después del infarto de miocardio, el grupo de dosis múltiples mostró un aumento en el número de células que expresan el marcador de células endoteliales, I-B4.
La aglutinina de germen de trigo y la tinción de alfa actinina sarcomérica en cardiomiocitos mostraron una reducción en el diámetro mínimo de fibra. Un menor número de núcleos de cardiomiocitos positivos para túnel en el grupo de dosis múltiples indicó una reducción de la apoptosis. El análisis de PCR detectó el ADN mitocondrial humano solo en el corazón, mostrando un trasplante específico.
Al insertar la aguja, asegúrese de que entre en la cavidad pericárdica junto con el margen superior del diafragma y al final del círculo espiratorio para evitar la lesión en el hígado o el pulmón.
