Это первый отчет, демонстрирующий, что чрескожная интрамиокардиальная инъекция кардиомиоцитов под контролем эхокардиографии значительно усиливает репаративные свойства кардиомиоцитов человека, полученных из iPS. Этот метод является осуществимой, удовлетворительной, воспроизводимой, менее инвазивной и эффективной процедурой для проведения терапии кардиомиоцитами, полученными из iPS человека. Мы считаем, что чрескожная интрамиокардиальная доставка является безопасным и эффективным методом местной доставки лекарств при таких заболеваниях, как ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда и сердечная недостаточность.
Этим проектом руководят профессор Цзиньфу Ян и профессор Цзюнь Пэн. Продемонстрацией процедуры будут Сюнь Ву, Келе Цинь и Кун Сян, доктор медицинских наук из моей лаборатории, и Ди Ван, доктор философии из ключевой лаборатории сердечно-сосудистых исследований провинции Хунань. Для начала вакуумируйте супернатант культуры из 60-дневной культуры hiPSC-CM.
Трижды промойте клетки ПБС. Затем диссоциируют hiPSC-CM на отдельные клетки, используя смесь ферментов отсоединения клеток при 37 градусах Цельсия в течение трех-пяти минут. Соберите клетки в 15-миллилитровую пробирку, содержащую пять миллилитров RPMI плюс среду B27, и перемешайте.
Подсчитайте ячейки и рассчитайте общее количество ячеек. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 г в течение двух минут при комнатной температуре. Откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте гранулу в среде поддержки кардиомиоцитов до концентрации 6 х 10 4-х клеток на микролитр.
Поместите трубку при температуре 37 градусов Цельсия до этапа инъекции. После того, как мышь достаточно обезболит, зафиксируйте конечности и хвост скотчем. Затем зафиксируйте резцы мыши шелковой нитью и лентой 2/0.
Стерилизуйте срединную шею и левую грудную клетку тремя чередующимися раундами бетаина с последующим алкоголем. Сделайте срединный разрез шеи с помощью тонких анатомических ножниц и тонких рассекающих щипцов. Отрежьте несколько передних шейных мышц, чтобы стабилизировать и полностью обнажить трахею.
Вставьте иглу для пункции катетера 20-го калибра в качестве трахеальной трубки через рот. Подключите трахеальную трубку к аппарату искусственной вентиляции легких и проверьте движение грудной клетки, чтобы убедиться, что оба легких хорошо вентилируются. Отрегулируйте параметры дыхания.
Затем зафиксируйте левую заднюю конечность на нижнюю правую сторону и ослабьте ленту вокруг левой верхней конечности. Тонкими рассекающими ножницами и щипцами выполните торакотомию в трех-четырех межреберных промежутках левой грудной клетки. С помощью щипцов снимите перикард и найдите левую переднюю нисходящую коронарную артерию.
Используйте шелковую нить 6/0, чтобы перевязать проксимальный конец артерии. Чтобы убедиться, что модель острого инфаркта миокарда установлена, подождите, пока дистальная сторона артерии в месте перевязки не изменится с красной на белую. Закройте грудную клетку слой за слоем и зашите кожу нитью 4/0.
Для фиктивной группы животных выполните все хирургические процедуры, кроме перевязки. В первые две недели после инфаркта миокарда поместите мышей в анестезиологическую коробку, подключенную к 5% изофторану, и проведите интубацию трахеи. За три дня до введения hiPSC-CM вводят циклоспорин А во внутрибрюшинную полость в дозе 10 миллиграмм на килограмм в сутки.
Удалите волосы с груди и верхней части живота мыши с помощью крема для депиляции. Подавайте ингаляции изофтораном до тех пор, пока частота сердечных сокращений не будет поддерживаться на уровне от 400 до 500 ударов в минуту. Зафиксируйте конечности и хвост мыши скотчем на консоли обнаружения и установите температуру платформы на уровне 37 градусов по Цельсию.
Нанесите ультразвуковое желе на верхнюю часть живота. Используя ветеринарный ультразвуковой датчик высокого разрешения, получите изображения печени мыши. Используя микрошприц объемом пять микролитров, наберите примерно 3 x 10 до 5-го hiPSC-CM.
Возьмите шприц и вставьте трехмиллиметровую иглу в левый параксифоидный отросток. Под ультразвуковым контролем следите за верхним краем диафрагмы. Наблюдайте за ритмом и диапазоном дыхания.
Вводят в перикард в конце круга выдоха, избегая повреждения печени и легких. Затем получите изображение сердца мыши с длинной осью парастерны с помощью эхокардиографии в B-режиме. Под ультразвуковым контролем вводят 1 x 10 в 5-е клетки hiPSC-CMs в каждую из трех маргинальных областей инфаркта.
Снимите ультразвуковой датчик и смойте желе. Отучите мышь от анестезии и верните ее в клетку. Вводите циклоспорин А непрерывно в течение одного месяца после трансплантации.
Эхокардиограмма левого желудочка показала, что травмы вследствие инфаркта миокарда были обращены вспять в группе многократной дозы. Трансплантация hiPSC-CM также приводила к увеличению фракции выброса и укорочению фракции. Измерение сердечных параметров с помощью окрашивания Sirius Red и Fast Green показало, что размер инфаркта и объемная доля коллагена уменьшились, тогда как толщина передней стенки левого желудочка увеличилась после трансплантации.
Маркировка неспецифического альфа-актина зеленым цветом, DAPI синим цветом и специфическим для человека тропонином Т красным цветом показала наличие трансплантированных клеток в области инфаркта и маргинального инфаркта. Количество и процент трансплантированных клеток были выше в группе многократной дозы по сравнению с однократной дозой. Через 28 дней после инфаркта миокарда в группе многократной дозы наблюдалось увеличение количества клеток, экспрессирующих маркер эндотелиальных клеток I-B4.
Окрашивание агглютинина зародышей пшеницы и саркомерного альфа-актинина на кардиомиоцитах показало снижение минимального диаметра волокна. Меньшее количество туннельно-положительных ядер кардиомиоцитов в группе многократной дозы указывало на снижение апоптоза. ПЦР-анализ выявил митохондриальную ДНК человека только в сердце, что свидетельствует о специфической трансплантации.
При введении иглы убедитесь, что она входит в полость перикарда вместе с верхним краем диафрагмы и в конце круга выдоха, чтобы избежать травмы печени или легкого.
