이것은 심근 세포의 심 초음파 유도 경피적 심근 내 주사가 인간 iPS 유래 심근 세포의 회복 특성을 크게 향상 시킨다는 것을 입증 한 첫 번째 보고서입니다. 이 방법은 인간 iPS 유래 심근세포 치료를 전달하기 위한 실현 가능하고 만족스럽고 반복 가능하며 덜 침습적이며 효과적인 절차입니다. 우리는 경피적 심근내 전달이 허혈성 심장 질환, 심근 경색 및 심부전을 포함한 질병에 대한 국소 약물 전달을 위한 안전하고 효율적인 방법이라고 믿습니다.
이 프로젝트는 Jinfu Yang 교수와 Jun Peng 교수가 감독합니다. 이 절차를 시연하는 것은 Xun Wu, Kele Qin 및 Kun Xiang, 내 실험실의 MD PhD와 Hunan Provincial Key Laboratory of Cardiovascular Research의 PhD 인 Di Wang이 될 것입니다. 시작하려면 hiPSC-CM의 60일 배양에서 배양 상청액을 진공 흡인합니다.
세포를 PBS로 세 번 세척한다. 그런 다음 섭씨 37도에서 3-5분 동안 세포 분리 효소 혼합물을 사용하여 hiPSC-CM을 개별 세포로 해리합니다. 5밀리리터의 RPMI와 B27 배지가 들어 있는 15밀리리터 튜브에 세포를 수집하고 혼합합니다.
셀을 세고 총 셀 수를 계산합니다. 세포 현탁액을 실온에서 2분 동안 300G에서 원심분리한다. 상청액을 버리고 펠릿을 심근 세포 지지 배지에 마이크로리터당 4번째 세포의 6 x 10 농도로 재현탁합니다.
주입 단계까지 튜브를 섭씨 37도에 놓습니다. 마우스를 충분히 마취 한 후 팔다리와 꼬리를 테이프로 고정하십시오. 그런 다음 마우스 앞니를 2/0 실크 실과 테이프로 고정합니다.
중앙 목과 왼쪽 가슴을 베타인을 세 번 번갈아 가며 소독한 다음 알코올을 주입합니다. 미세한 해부학적 가위와 미세 해부 집게를 사용하여 중앙 목 절개를 합니다. 기관을 안정시키고 완전히 노출시키기 위해 몇 개의 전방 자궁 경부 근육을 잘라냅니다.
20게이지 카테터 천자 바늘을 기관 튜브로 입을 통해 삽입합니다. 기관 튜브를 인공 호흡기에 연결하고 흉부 움직임을 확인하여 양쪽 폐가 잘 환기되는지 확인하십시오. 호흡 매개 변수를 조정하십시오.
그런 다음 왼쪽 뒷다리를 오른쪽 하단에 다시 고정하고 왼쪽 상지 주위의 테이프를 풉니다. 미세 해부 가위와 집게를 사용하여 왼쪽 흉부의 3-4 늑간 공간에서 개흉술을 시행하십시오. 집게를 사용하여 심낭을 떼어내고 왼쪽 전방 하행 관상 동맥을 찾습니다.
6/0 실크 실을 사용하여 동맥의 근위 끝을 결찰합니다. 급성 심근경색 모델이 확립되도록 하려면 결찰 부위의 동맥 원위부가 빨간색에서 흰색으로 바뀔 때까지 기다리십시오. 가슴을 층별로 닫고 4/0 실로 피부를 봉합하십시오.
가짜 동물 그룹의 경우 결찰을 제외한 모든 수술 절차를 수행하십시오. 심근 경색 후 처음 2 주 동안 마우스를 5 % 이소 플루오란과 연결된 마취 상자에 넣고 기관 삽관을 시행합니다. hiPSC-CM을 투여하기 3 일 전에 사이클로스포린 A를 하루 킬로그램 당 10 밀리그램의 용량으로 복강 내 주사하십시오.
탈모 크림으로 마우스의 가슴과 상복부에서 머리카락을 제거하십시오. 심박수가 분당 400 내지 500 비트로 유지될 때까지 흡입 이소플루오란을 공급한다. 감지 콘솔에 테이프로 마우스 팔다리와 꼬리를 고정하고 플랫폼 온도를 섭씨 37도로 설정합니다.
상복부에 초음파 젤리를 바릅니다. 고해상도 수의학 초음파 프로브를 사용하여 마우스 간 이미지를 얻습니다. 5마이크로리터 마이크로 주사기를 사용하여 약 3 x 10을 5번째 hiPSC-CM에 그립니다.
주사기를 잡고 왼쪽 paraxiphoid process에 3 밀리미터 바늘을 삽입하십시오. 초음파 유도에서 다이어프램의 상단 가장자리를 따르십시오. 호흡 리듬과 범위를 관찰하십시오.
호기 원의 끝에서 심낭에 들어가 간과 폐의 손상을 피하십시오. 그런 다음 B 모드 심초음파로 마우스 심장의 흉골주위 장축 이미지를 획득합니다. 초음파 유도하에 1 x 10을 5번째 hiPSC-CMs 세포에 경색 부위의 3개 가장자리 영역 각각에 주입합니다.
초음파 프로브를 제거하고 젤리를 헹굽니다. 마우스를 마취에서 떼어 내고 새장으로 되돌립니다. 사이클로스포린 A를 이식 후 1개월 동안 지속적으로 주사합니다.
좌심실의 심초음파는 심근경색으로 인한 손상이 다회 투여군에서 역전된 것으로 나타났다. hiPSC-CM의 이식은 또한 박출률 증가 및 분획 단축을 가져왔다. 시리우스 레드(Sirius Red) 및 패스트 그린(Fast Green) 염색을 이용한 심장 파라미터 측정은 이식 후 경색 크기와 콜라겐 부피 분율이 감소한 반면, 좌심실 전벽 두께는 증가한 것으로 나타났다.
녹색의 비특이적 알파 액틴, 파란색의 DAPI 및 빨간색의 인간 특이적 트로포닌 T에 대한 표지는 경색 및 변연부 경색 영역에 이식된 세포의 존재를 보여주었습니다. 이식된 세포의 수 및 백분율은 단일 투여에 비해 다중 투여군에서 더 높았다. 심근 경색 28일 후, 다중 투여 그룹은 내피 세포 마커인 I-B4를 발현하는 세포의 수의 증가를 보였다.
심근 세포에 대한 밀 배아 응집소 및 육종 알파 액티닌 염색은 최소 섬유 직경의 감소를 보여주었습니다. 다중 투여군에서 터널 양성 심근세포 핵의 수가 적을수록 세포자멸사 감소를 나타냅니다. PCR 분석은 심장에서만 인간 미토콘드리아 DNA를 검출하여 특이적 이식을 보여주었습니다.
바늘을 삽입할 때 간이나 폐의 손상을 방지하기 위해 횡격막의 위쪽 가장자리와 호기원의 끝과 함께 심낭강에 들어가야 합니다.
