هذا هو التقرير الأول الذي يوضح أن الحقن داخل عضلة القلب الموجه بتخطيط صدى القلب عن طريق الجلد لخلايا عضلة القلب يعزز بشكل كبير الخاصية التعويضية لخلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPS. هذه الطريقة ممكنة ومرضية وقابلة للتكرار وأقل توغلا وفعالية لتقديم علاج خلايا عضلة القلب البشرية المشتقة من iPS. نعتقد أن الولادة داخل عضلة القلب عن طريق الجلد هي طريقة آمنة وفعالة لتوصيل الأدوية المحلية للأمراض بما في ذلك أمراض القلب الإقفارية واحتشاء عضلة القلب وفشل القلب.
ويشرف على هذا المشروع البروفيسور جينفو يانغ والبروفيسور جون بينغ. يوضح الإجراء سيكون Xun Wu و Kele Qin و Kun Xiang ، دكتوراه في الطب من مختبري و Di Wang ، دكتوراه من مختبر مقاطعة هونان الرئيسي لأبحاث القلب والأوعية الدموية. للبدء ، قم بشفط طاف الثقافة من ثقافة hiPSC-CMs لمدة 60 يوما.
اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات. ثم افصل hiPSC-CMs إلى خلايا فردية باستخدام خليط إنزيم انفصال الخلية عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. اجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من RPMI بالإضافة إلى وسط B27 واخلطه.
عد الخلايا واحسب العدد الإجمالي للخلايا. أجهزة الطرد المركزي تعليق الخلية عند 300G لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في وسط دعم عضلة القلب إلى تركيز 6 × 10 من الخلايا الرابعة لكل ميكرولتر.
ضع الأنبوب على حرارة 37 درجة مئوية حتى خطوة الحقن. بعد تخدير الماوس بشكل كاف ، قم بإصلاح الأطراف والذيل بشريط. ثم قم بإصلاح قواطع الماوس بخيط وشريط حريري 2/0.
تعقيم الرقبة المتوسطة والصدر الأيسر بثلاث جولات متناوبة من البيتين تليها الكحول. قم بعمل شق متوسط في الرقبة باستخدام مقص تشريحي دقيق وملقط تشريح دقيق. قطع عدد قليل من عضلات عنق الرحم الأمامية لتحقيق الاستقرار وكشف القصبة الهوائية بالكامل.
أدخل إبرة ثقب قسطرة قياس 20 كأنبوب قصبة هوائية عبر الفم. قم بتوصيل أنبوب القصبة الهوائية بجهاز التنفس الصناعي وتحقق من حركة الصدر للتأكد من أن كلتا الرئتين جيدة التهوية. ضبط معلمات التنفس.
بعد ذلك ، أعد تثبيت الطرف الخلفي الأيسر إلى الجانب الأيمن السفلي وقم بفك الشريط حول الطرف العلوي الأيسر. باستخدام مقص وملقط تشريح دقيق ، قم بإجراء بضع الصدر في المساحة الوربية من ثلاثة إلى أربعة من الصدر الأيسر. باستخدام الملقط ، انزع التامور وحدد موقع الشريان التاجي الأمامي الأيسر النازل.
استخدم خيطا حريريا 6/0 لربط الطرف القريب من الشريان. للتأكد من إنشاء نموذج احتشاء عضلة القلب الحاد ، انتظر حتى يتغير الجانب البعيد من الشريان في موقع الربط من الأحمر إلى الأبيض. أغلق طبقة الصدر بطبقة وخيط الجلد بخيط 4/0.
بالنسبة لمجموعة الحيوانات الوهمية ، قم بإجراء جميع العمليات الجراحية باستثناء الربط. في الأسبوعين الأولين بعد احتشاء عضلة القلب ، ضع الفئران في صندوق تخدير متصل ب 5٪ إيزوفلوران وقم بإجراء التنبيب الرغامي. قبل ثلاثة أيام من إعطاء hiPSC-CMs ، حقن السيكلوسبورين A في التجويف داخل الصفاق بجرعة 10 ملليغرام لكل كيلوغرام في اليوم.
إزالة الشعر من الصدر والجزء العلوي من البطن من الماوس مع كريم مزيل الشعر. استنشاق الإمداد isofluorane حتى يتم الحفاظ على معدل ضربات القلب في 400 إلى 500 نبضة في الدقيقة. ثبت أطراف الماوس والذيل بشريط على وحدة التحكم في الكشف واضبط درجة حرارة المنصة على 37 درجة مئوية.
ضع هلام الموجات فوق الصوتية على الجزء العلوي من البطن. باستخدام مسبار الموجات فوق الصوتية البيطرية عالية الدقة ، احصل على صور كبد الفأر. باستخدام حقنة صغيرة سعة خمسة ميكرولتر ، ارسم ما يقرب من 3 × 10 إلى 5 hiPSC-CMs.
امسك المحقنة وأدخل إبرة ثلاثة ملليمترات في عملية paraxiphoid اليسرى. تحت توجيه الموجات فوق الصوتية ، اتبع الحافة العلوية للحجاب الحاجز. مراقبة إيقاع الجهاز التنفسي والمدى.
أدخل التامور في نهاية دائرة الزفير ، وتجنب تلف الكبد والرئة. ثم احصل على صورة المحور الطويل لقلب الفأر عن طريق تخطيط صدى القلب في الوضع B. تحت التوجيه بالموجات فوق الصوتية ، حقن 1 × 10 إلى خلايا hiPSC-CMs الخامسة في كل من المناطق الهامشية الثلاث لموقع الاحتشاء.
إزالة مسبار الموجات فوق الصوتية وشطف الهلام. فطم الفأر عن التخدير وأعده إلى قفصه. حقن السيكلوسبورين أ بشكل مستمر لمدة شهر واحد بعد الزرع.
أظهر مخطط صدى القلب للبطين الأيسر أن الإصابات الناجمة عن احتشاء عضلة القلب قد انعكست في مجموعة الجرعات المتعددة. أدى زرع hiPSC-CMs أيضا إلى زيادة الكسر القذفي وتقصير الكسر. أظهر قياس معلمات القلب باستخدام تلوين Sirius Red و Fast Green أن حجم الاحتشاء وجزء حجم الكولاجين قد انخفض ، بينما زاد سمك جدار البطين الأمامي الأيسر بعد الزرع.
أظهر وضع العلامات على أكتين ألفا غير المحدد باللون الأخضر ، و DAPI باللون الأزرق ، والتروبونين T الخاص بالإنسان باللون الأحمر وجود خلايا مزروعة في منطقة احتشاء واحتشاء هامشي. كان عدد ونسبة الخلايا المزروعة أعلى في مجموعة الجرعات المتعددة مقارنة بالجرعة الواحدة. بعد 28 يوما من احتشاء عضلة القلب ، أظهرت مجموعة الجرعات المتعددة زيادة في عدد الخلايا التي تعبر عن علامة الخلايا البطانية ، I-B4.
أظهر تلطيخ جرثومة القمح و sarcomeric alpha actinin على خلايا عضلة القلب انخفاضا في الحد الأدنى لقطر الألياف. أشار انخفاض عدد نوى خلايا عضلة القلب الإيجابية النفقية في مجموعة الجرعات المتعددة إلى انخفاض موت الخلايا المبرمج. كشف تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل عن الحمض النووي للميتوكوندريا البشرية فقط في القلب ، مما يدل على زرع محدد.
عند إدخال الإبرة ، تأكد من دخولها إلى تجويف التامور مع الهامش العلوي للحجاب الحاجز وفي نهاية دائرة الزفير لتجنب إصابة الكبد أو الرئة.
