白色念珠菌中转录因子-DNA结合相互作用的全基因组分析:全面的CUT&RUN方法和数据分析工作流程

该协议详细介绍了所有实验程序，从转录因子编码基因的表位标记到计算数据分析，再到通过CUT&RUN对白色念珠菌中的转录因子- DNA结合相互作用进行全基因组分析。这是一种更易于访问、更快、更灵敏、更便宜的技术，并且比传统的 ChIP 芯片和 ChIP-seq 方法提供更高质量的数据。虽然我们的方案是为从生物膜或浮游培养物中分离的白色念珠菌细胞开发的，但将其适应几乎任何良好形式的白色念珠菌细胞应该是实用的。

孵育细胞悬浮液后，将五微升等分试样转移到新的PCR管中。对于五微升分离的细胞核和先前在四摄氏度下储存的五微升完整细胞的等分试样，加入钙荧光白和SYTO 13各一微升。在30摄氏度的黑暗中孵育30分钟。

使用荧光显微镜目视检查分离细胞核的完整性和纯度。寻找显示突出SYTO 13染色的分离细胞核，并确保钙荧光白色染料不会对细胞壁进行染色。用完整的细胞重复检测，作为用钙氟白色染料染色细胞壁的对照。

将管子放在磁性架上，等待浆料完全清除。使用移液器丢弃上清液。加入50微升抗体缓冲液，并通过移液轻轻混合。

向试管中加入三微升抗GFP多克隆抗体，并将试管在4摄氏度的螺母混合器上孵育两小时。在室温下以100倍g离心管5秒钟，并将管放在磁性架上。一旦浆料变清，使用移液器丢弃上清液。

当带有磁珠的管子仍在磁性架上时，直接在磁珠上添加200微升冰冷的电池渗透缓冲液。使用移液器丢弃上清液。用冰冷的细胞渗透缓冲液重复两次洗涤。

向每个试管中加入50微升冰冷的细胞渗透缓冲液，并通过移液轻轻混合。向每个样品中加入2.5微升蛋白质AG-MNase，并通过移液混合。将样品放在4摄氏度的螺母混合器上，并将样品孵育一小时。

在室温下以100倍的重量将带状管短暂离心5秒钟，然后将管放在磁性架上。一旦浆料变清，使用移液器丢弃上清液。当带有磁珠的管子仍在磁性架上时，直接在磁珠上添加200微升冰冷的电池渗透缓冲液。

使用移液器丢弃上清液。用冰冷的细胞渗透缓冲液重复两次洗涤。向样品中加入100微升冰冷的细胞渗透缓冲液，轻轻上下移液五次。

从凝胶盒中取出凝胶铸件，然后按照制造商的说明打开凝胶铸件。轻轻地从凝胶铸件中取出凝胶，并将其放入含有100毫升单强度TBE的凝胶保持托盘中。将10微升核酸凝胶染色剂加入托盘并轻轻旋转。

盖上铝箔，避光，在室温下静态孵育10分钟。然后用100毫升去离子自来水冲洗凝胶两次。使用琥珀色滤光片盖在蓝光照明下对凝胶进行成像。

对于每个文库，将凝胶切至略高于约125碱基对突出的适配器二聚体带和低于400碱基对梯形标记的下方。使用22号针刺穿0.65毫升管的底部，并将穿刺的管放入无菌的两毫升微量离心管内。将凝胶切片转移到两毫升微量离心管内的穿刺管中。

将装有0.65毫升刺破管的两毫升微量离心管和样品在室温下以10， 000倍g离心两分钟，以收集凝胶浆液在两毫升微量离心管内。向凝胶浆液中加入300微升冰冷的凝胶洗脱缓冲液。在室温下在螺母上混合至少三小时或过夜。

将所有液体和凝胶浆液转移到0.22微米过滤柱中，并在室温下以10， 000 g离心一分钟。从GitHub页面下载CUT&RUN分析的源代码，方法是单击绿色的代码按钮，然后单击"下载ZIP"选项。将文件夹解压缩到本地计算机上的相关位置。

安装 Conda Environment 并仅运行一次。安装 Conda 后，创建一个附带相关命令的虚拟环境。每次执行此工作流时激活虚拟环境。

通过可视化对照完整细胞和用荧光细胞壁和核酸染色的分离细胞核来评估细胞壁消化和核完整性。与未观察到细胞壁染色的分离完整细胞核相反，细胞核和细胞壁在完整的对照细胞中都以荧光标记。该图显示了使用毛细管电泳仪器分析的CUT&RUN TF库。

成功的CUT&RUN TF库针对小于200个碱基对的短片段进行了丰富。次优的CUT&RUN TF文库显示大DNA片段的富集。该图显示，Ndt80 DNA结合基序在CUT&RUN鉴定的所有Ndt80结合位点上都富集，表明通过该方法鉴定的额外峰可能是真正的Ndt80结合位点。

比较分析表明，CUT&RUN方案确定了生物膜形成过程中Ndt80和Efg1的大多数先前已知的结合事件。总体而言，Ndt80和Efg1结合位点与先前发表的染色质免疫沉淀ChIP数据重叠，并且仅使用CUT&RUN进行鉴定。它使我们能够显着增加我们专注于转录调节网络和白色念珠菌的研究范围和速度。