Bu protokol, tutarlı anti-Stokes Raman saçılması ve uyarılmış Raman saçılma süreçleri de dahil olmak üzere en yaygın kullanılan iki hiperspektral tutarlı Raman saçılma tekniğini karşılaştırır ve bu, biyologların biyolojik uygulamaları için en iyi görüntüleme yöntemini seçmelerini sağlar. İçsel titreşimsel imzaları kullanarak, tutarlı Raman spektroskopisi, eksojen etiketlemeye gerek kalmadan kimyasal bilgileri ve biyolojik numuneleri haritalayabilir. Tutarlı Raman mikroskobu, hücresel metabolizma, haritalama, ilaç dağılımları, hastalık teşhisi ve kimyasal değişikliklerin ölçülmesi konusundaki anlayışımızı genişletmiştir.
Bu, hem optik hem de spektroskopide yeterli eğitim gerektiren bir tekniktir. Bu tekniği kullanmadan önce birkaç inceleme makalesi okumanızı ve bir uzman tarafından eğitilmenizi tavsiye ederim. Başlamak için, bir kapak kayması üzerine çift taraflı bir bant parçası yerleştirerek görüntüleme slaytlarını hazırlayın ve numunenin yerleştirilmesi için açık bir alan oluşturmak üzere bandın ortasından bandın küçük bir dikdörtgen şeklini kesin.
Pipet 1 ila 2 mikrolitre saf DMSO ve damlacığı boşluğun merkezine dağıtın. Üst kapak kaymasını dikkatlice yerleştirin ve DMSO numunesinin bandın kenarlarına temas etmediğinden emin olurken odayı kapatmak için kapak kaymalarının kenarlarını yavaşça yerleştirin. Hassasiyet deneyleri için,% 50 ila% 0'lık bir konsantrasyon aralığı vermek için döteryum oksitte DMSO'nun seri seyreltmelerini hazırlayın Her çözeltiden 1 ila 2 mikrolitre alın ve daha önce gösterildiği gibi preslenmiş numuneler hazırlayın.
Numuneyi mikroskop aşamasına yerleştirin ve objektif lens veya kondenser için gerekirse su veya daldırma yağı ekleyin. DMSO damlacığının kenarını görüş alanında düzgün bir şekilde hareket ettirin ve objektif lensi en iyi odak için ayarlayın, ardından Kohler aydınlatma yöntemini kullanarak kondenseri ortalayın ve kondenserdeki diyaframı tamamen açın. Daha sonra, 2913 dalga numarası CH3 zirvesini hedeflemek için pompa ışını dalga boyunu 800 nanometreye ayarlayın ve yarım dalga plakasını ayarlayarak mikroskoptan önce hem pompanın hem de Stokes ışınının gücünü yaklaşık 30 miliwatt'a ayarlayın.
SRS için, kilitlenme amplifikatörü kazancını 7 mikrosaniyelik bir zaman sabitiyle yaklaşık 10'a ayarlayarak zaman sabitinin piksel bekleme süresinden daha küçük olmasını sağlayın. Görüntü alma parametrelerini ve yakalama yazılımını, yaklaşık 100 x 100 mikrometre tarama boyutunda 200 x 200 piksel numarası kullanarak ayarlayın, görüntünün hem DMSO damlacığını hem de boş bir alanı içerdiğinden emin olun, ardından numuneyi tarayın ve görüntüyü bilgisayar ekranında kontrol edin. Ardından, gerçek zamanlı görüntüleri izlerken Stokes pompa ışınındaki motorlu gecikme görüntüsünü tarayın ve sinyal en üst düzeye çıkarılana kadar gecikmeyi tarayın.
DMSO damlacığını tüm görüş alanını kaplayacak şekilde hareket ettirin ve sinyal pompa ışınına bağımlı olduğu için DC sinyal maksimumunun görüntüde ortalanıp ortalanmadığını kontrol edin. Pompa ışınının konumunu bir ayna aracılığıyla veya görüntüleme yazılımındaki voltaj ofsetini ayarlayın. DC optimizasyonundan sonra, eşik değerini görüntüde doygunluğun ortalandığını kontrol ederken yaklaşık %50 doygunluk gösterecek şekilde ayarlayarak AC sinyali en üst düzeye çıkana kadar Stokes ışın aynalarını ayarlayın.
Değilse, aynalara yalnızca Stokes ışınında ince ayar yapın ve hizalama sırasında sinyali, hizalamanın kalitesi hakkında gerçek zamanlı geri bildirim olarak izleyin. SNR analizi için ImageJ yazılımını açın ve kaydedilen DMSO örnek metin dosyasını Dosya'ya, ardından İçe Aktar'a ve ardından açılır menüden Metin Görüntüsü ve Aç seçeneklerine tıklayarak içe aktarın. Görüntü içe aktarıldıktan sonra, Parlaklık ve Kontrast işlevini açmak için Control Shift C düğmesine basın, ardından maksimum örnek sinyalini bulmak için DMSO örneğinin bölgesi doygun görünene kadar Parlaklık ve Kontrast işlevindeki Otomatik düğmesine basın.
Ardından, ImageJ arayüzündeki Oval seçim aracını tıklayın ve doymuş DMSO bölgesinin küçük bir alanını vurgulayın. Vurguladıktan sonra, seçilen alanın ortalama ve standart sapmasını ölçmek için M tuşuna basın. Arka planı ölçmek için, boş bölgenin sinyali gözlemlenene kadar Parlaklık ve Kontrast işlevindeki çubukları ayarlayın, ardından Oval seçimi tıklayın ve seçilen bölgenin DMSO içermediğinden emin olarak arka planın bir bölgesini vurgulayın.
Daha sonra, seçilen alanın istatistiklerini ölçmek için M tuşuna basın. Ardından, standart sapma ile birlikte gürültü ortalama değerini ve sinyal ortalama değerini ölçerek SNR'yi daha önce gösterildiği gibi hesaplayın. Hiperspektral CRS görüntülerini işlemek için, açılır menüden Dosya'ya, ardından İçe Aktar, Metin Görüntüsü ve Aç seçeneklerine tıklayarak metin dosyasını içe aktarın.
İçe aktarıldıktan sonra, dosyayı bir görüntü yığınına dönüştürmek için Görüntü'ye, ardından Yığınlar'a, ardından Araçlar ve Yığına Montaj seçeneklerine tıklayın, ardından ilk DMSO zirvesi görünene kadar montaj arasında gezinin. DMSO'da bir bölge seçin ve Görüntü'ye tıklayın, ardından yoğunluğa karşı kare numarası spektrumunu çizmek için Yığın ve Z ekseni Profilini Çiz seçeneklerine tıklayın. Ardından, Liste'ye tıklayın ve ham spektral verileri çıkarmak için profil verilerini kopyalayın.
Kurtarılan spektrumu frekans birimlerine dönüştürmek için, DMSO'dan gelen simetrik ve asimetrik CH gerilmesini ve bunlara karşılık gelen kare numaralarını kullanarak doğrusal bir regresyon gerçekleştirin. DMSO'nun spektral çözünürlüğü, SRS'nin daha iyi bir spektral çözünürlüğe sahip olduğunu gösteren, sırasıyla 14.6 ve 17.1 dalga sayısı çözünürlüğünü gösteren bir hiperspektral SRS ve CARS mikroskobu kullanılarak ölçülmüştür. DMSO SRS spektrumları, 2913 dalga sayısındaki zirvenin birincisinde çözülebildiği, ancak ikincisinde çözülemediği% 0.1 ve% 0.01 konsantrasyonlarında elde edildi, bu da algılama sınırının% 0.1 ila% 0.01 DMSO arasında olduğunu gösteriyor.
Faz alınan CARS spektrumları, DMSO 2913 dalga sayısı zirvesinin% 0.1 DMSO için açıkça çözülebileceğini,% 0.01'in bu iki konsantrasyon arasında bir algılama sınırını göstermediğini göstermektedir. Bir MIA PaCA-2 hücresinin SRS ve CARS yoğunluk profilleri, SRS sinyalinin 398.6 nanometre çözünürlük verdiğini, CARS sinyalinin ise 330.3 nanometrenin 1.2 kat daha iyi çözünürlüğünü verdiğini gösterdi. Farklı optik gecikme konumlarındaki MIA PaCa-2 hücrelerinden gelen SRS ve CARS görüntüleri, lipit damlacıkları ile en güçlü sinyalleri SRS için parlak noktalar olarak gösterirken, CARS çok daha düşük kontrastlara sahiptir.
Bununla birlikte, spektral odaklamadaki 37 dalga sayılı kırmızı kayma, hem SRS hem de CARS için lipit kontrastlarını geliştirdi. SRS spektrumları, lipit damlacıkları için 2850 dalga sayısında diğer organellere göre çok daha güçlü bir sinyal gösterirken, CARS spektrumları küçük bir kırmızı kayma gösterir. Tutarlı Raman saçılma sinyalini optimize etmek için, önce örnek odağı bulun, ardından optik gecikmeyi ayarlayın ve son olarak, maksimum seviyeye ulaşılana kadar aynalara ince ayar yapın.
Geçici absorpsiyon gibi diğer pompa probu teknolojileri, CRS platformuna doğal olarak entegre edilmiştir. Bu teknoloji, floresan olmayan molekülleri emen güçlü ışığın absorpsiyon kinetiğini ölçmek için çok güçlüdür. Bu teknik, araştırmacıların küçük molekülleri yüksek kimyasal hücre aktivitesine sahip etiketsiz bir şekilde görmelerini sağlar.
Ayrıca araştırmacıların lipit metabolizması, hücre içi dinamikler ve ilaç dağılımlarındaki değişiklikleri görmelerini sağlar.
