Este protocolo compara las dos técnicas de dispersión Raman coherentes hiperespectrales más utilizadas, incluida la dispersión Raman anti-Stokes coherente y los procesos de dispersión Raman estimulados, y esto permite a los biólogos elegir la mejor modalidad de imagen para sus aplicaciones biológicas. Utilizando las firmas vibratorias intrínsecas, la espectroscopia Raman coherente es capaz de mapear información química y muestras biológicas sin la necesidad de un etiquetado exógeno. La microscopía Raman coherente ha ampliado nuestra comprensión del metabolismo celular, el mapeo, la distribución de medicamentos, el diagnóstico de enfermedades y la cuantificación de cambios químicos.
Esta es una técnica que requiere suficiente entrenamiento tanto en óptica como en espectroscopia. Recomendaría leer algunos artículos de revisión y ser entrenado por un experto antes de usar esta técnica. Para comenzar, prepare las diapositivas de imágenes colocando un trozo de cinta de doble cara en un resbalón de cubierta y recorte una pequeña forma rectangular de la cinta desde el centro de la cinta para crear un área abierta para que se coloque la muestra.
Pipetee de 1 a 2 microlitros de DMSO puro y dispense la gota en el centro de la vacante. Coloque con cuidado el deslizamiento de la cubierta superior y coloque suavemente los bordes de los resbalones de la cubierta para sellar la cámara mientras se asegura de que la muestra DMSO no entre en contacto con los bordes de la cinta. Para experimentos de sensibilidad, prepare diluciones en serie de DMSO en óxido de deuterio para dar un rango de concentración de 50 a 0%Tome de 1 a 2 microlitros de cada solución y prepare muestras prensadas como se demostró anteriormente.
Coloque la muestra en el escenario del microscopio y agregue agua o aceite de inmersión si es necesario para la lente o el condensador del objetivo. Mueva correctamente el borde de la gota DMSO en el campo de visión y ajuste la lente del objetivo para obtener el mejor enfoque, luego centre el condensador utilizando el método de iluminación Kohler y abra completamente el diafragma en el condensador. A continuación, ajuste la longitud de onda del haz de la bomba a 800 nanómetros para apuntar al pico CH3 del número de onda 2913 y ajuste la potencia tanto de la bomba como del haz stokes a aproximadamente 30 milivatios antes del microscopio ajustando la placa de media onda.
Para SRS, establezca la ganancia del amplificador de bloqueo en aproximadamente 10 con una constante de tiempo de 7 microsegundos, lo que garantiza que la constante de tiempo sea menor que el tiempo de permanencia de píxeles. Establezca los parámetros de adquisición de imágenes y el software de adquisición utilizando un número de píxeles de 200 por 200 con el tamaño de escaneo de aproximadamente 100 por 100 micrómetros cuadrados, asegurándose de que la imagen contenga tanto la gota DMSO como un área vacía, luego escanee la muestra y verifique la imagen en la pantalla de la computadora. A continuación, escanee la imagen de retardo motorizado en el haz de la bomba Stokes mientras monitorea las imágenes en tiempo real y escanee sobre el retraso hasta que se maximice la señal.
Mueva la gota DMSO para cubrir todo el campo de visión y compruebe si el máximo de señal de CC está centrado en la imagen, ya que la señal depende del haz de bombeo. Ajuste la posición del haz de la bomba a través de un espejo o el desplazamiento de voltaje en el software de imágenes. Después de la optimización de CC, ajuste los espejos de haz stokes hasta que se maximice la señal de CA ajustando el valor umbral para mostrar aproximadamente el 50% de saturación mientras verifica que la saturación esté centrada en la imagen.
De lo contrario, ajuste los espejos solo en el haz de Stokes y monitoree la señal durante la alineación como retroalimentación en tiempo real sobre la calidad de la alineación. Para el análisis SNR, abra el software ImageJ e importe el archivo de texto de muestra DMSO guardado haciendo clic en Archivo, luego en Importar, seguido de las opciones Imagen de texto y Abrir del menú desplegable. Una vez importada la imagen, pulse Control Shift C para que aparezca la función Brillo y contraste, y, a continuación, pulse el botón Automático en la función Brillo y contraste hasta que la región de la muestra DMSO aparezca saturada para encontrar la señal de muestra máxima.
A continuación, haga clic en la herramienta de selección Oval en la interfaz ImageJ y resalte un área pequeña de la región DMSO saturada. Después de resaltar, presione M para medir la media y la desviación estándar del área seleccionada. Para medir el fondo, ajuste las barras de la función Brillo y contraste hasta que se pueda observar la señal de la región vacía, luego haga clic en la selección Oval y resalte una región del fondo, asegurándose de que la región seleccionada no contenga DMSO.
Después, presione M para medir las estadísticas del área seleccionada. A continuación, calcule el SNR como se demostró anteriormente midiendo el valor medio de ruido y el valor medio de la señal junto con la desviación estándar. Para procesar las imágenes CRS hiperespectrales, importe el archivo de texto haciendo clic en Archivo y, a continuación, en las opciones Importar, Imagen de texto y Abrir en el menú desplegable.
Una vez importado, haga clic en Imagen, luego en Pilas, seguido de las opciones Herramientas y Montaje a Pila para convertir el archivo en una pila de imágenes, luego desplácese por el montaje hasta que el primer pico DMSO sea visible. Seleccione una región en el DMSO y haga clic en Imagen, seguido de las opciones Apilar y Trazar perfil de eje Z para trazar el espectro de intensidad versus número de fotograma. A continuación, haga clic en Lista y copie los datos del perfil para extraer los datos espectrales sin procesar.
Para convertir el espectro recuperado en unidades de frecuencia, realice una regresión lineal utilizando el estiramiento CH simétrico y asimétrico de DMSO y sus correspondientes números de trama. La resolución espectral del DMSO se midió utilizando una microscopía hiperespectral SRS y CARS, que muestran una resolución de 14.6 y 17.1 números de onda respectivamente, lo que indica que SRS tiene una mejor resolución espectral. Los espectros DMSO SRS se obtuvieron a concentraciones de 0.1 y 0.01% en las que el pico en el número de onda 2913 se puede resolver en el primero, pero no en el segundo, lo que indica que el límite de detección está entre 0.1 y 0.01% DMSO.
Los espectros CARS recuperados en fase muestran que el pico de número de onda DMSO 2913 se puede resolver claramente para el 0.1% DMSO, pero no el 0.01%que indica un límite de detección entre estas dos concentraciones. Los perfiles de intensidad SRS y CARS de una célula MIA PaCA-2 demostraron que la señal SRS dio una resolución de 398,6 nanómetros, mientras que la señal CARS dio una resolución 1,2 veces mejor de 330,3 nanómetros. Las imágenes SRS y CARS de las células MIA PaCa-2 en diferentes posiciones de retardo óptico muestran las señales más fuertes con gotas de lípidos como puntos brillantes para SRS, mientras que CARS tiene contrastes muy reducidos.
Sin embargo, un cambio al rojo de 37 números de onda en el enfoque espectral mejoró los contrastes de lípidos tanto para SRS como para CARS. Los espectros SRS muestran una señal mucho más fuerte en un número de onda de 2850 para las gotas de lípidos que otros orgánulos, mientras que los espectros CARS muestran un pequeño desplazamiento al rojo. Para optimizar la señal de dispersión Raman coherente, primero busque el enfoque de la muestra, luego ajuste el retardo óptico y, finalmente, ajuste los espejos hasta que se logre un máximo.
Otras tecnologías de bomba-sonda, como la absorción transitoria, están inherentemente integradas en la plataforma CRS. Esta tecnología es muy potente para medir la cinética de absorción de moléculas no fluorescentes que absorben luz fuerte. Esta técnica permite a los investigadores ver moléculas pequeñas de una manera libre de etiquetas con alta actividad química celular.
También permite a los investigadores ver los cambios en el metabolismo de los lípidos, la dinámica intracelular y la distribución de fármacos.
