Этот протокол сравнивает два наиболее широко используемых гиперспектральных когерентных метода рамановского рассеяния, включая когерентное рамановское рассеяние против Стокса и стимулированные процессы рамановского рассеяния, и это позволяет биологам выбирать лучшую модальность визуализации для их биологических применений. Используя внутренние вибрационные сигнатуры, когерентная рамановская спектроскопия способна отображать химическую информацию и биологические образцы без необходимости экзогенной маркировки. Когерентная рамановская микроскопия расширила наше понимание клеточного метаболизма, картирования, распределения лекарств, диагностики заболеваний и количественной оценки химических изменений.
Это метод, который требует достаточной подготовки как в оптике, так и в спектроскопии. Я бы порекомендовал прочитать несколько обзорных статей и пройти обучение у эксперта, прежде чем использовать эту технику. Для начала подготовьте слайды изображения, поместив кусок двусторонней ленты на крышку и вырезав небольшую прямоугольную форму ленты из середины ленты, чтобы создать открытую область для размещения образца.
Пипетку 1 к 2 микролитрам чистого ДМСО и дозируют капельку в центре вакансии. Осторожно поместите верхнюю крышку и аккуратно поместите края скольжения крышки, чтобы запечатать камеру, убедившись, что образец DMSO не соприкасается с краями ленты. Для экспериментов по чувствительности подготовьте серийные разведения ДМСО в оксиде дейтерия с получением диапазона концентраций от 50 до 0%, возьмите от 1 до 2 микролитров каждого раствора и подготовьте прессованные образцы, как было продемонстрировано ранее.
Поместите образец на ступень микроскопа и добавьте воду или иммерсионное масло, если это необходимо для объектива или конденсатора. Правильно переместите край капли DMSO в поле зрения и отрегулируйте объектив для наилучшей фокусировки, затем центрируйте конденсатор с помощью метода подсветки Колера и полностью откройте диафрагму на конденсаторе. Затем настройте длину волны пучка насоса на 800 нанометров, чтобы нацелиться на пик волнового числа CH3 2913 и установить мощность как насоса, так и пучка Стокса примерно на 30 милливатт перед микроскопом, отрегулировав полуволновую пластину.
Для SRS установите коэффициент усиления блокирующего усилителя примерно на 10 с константой времени 7 микросекунд, гарантируя, что постоянная времени меньше, чем время ожидания пикселя. Установите параметры получения изображения и программное обеспечение для сбора, используя число пикселей 200 на 200 с размером сканирования приблизительно 100 на 100 квадратных микрометров, убедившись, что изображение содержит как каплю DMSO, так и пустую область, затем отсканируйте образец и проверьте изображение на экране компьютера. Затем отсканируйте моторизованное изображение задержки в пучке насоса Stokes, отслеживая изображения в режиме реального времени, и сканируйте задержку до тех пор, пока сигнал не будет максимизирован.
Переместите каплю DMSO, чтобы охватить все поле зрения, и проверьте, центрирован ли максимум сигнала постоянного тока на изображении, поскольку сигнал зависит от пучка насоса. Отрегулируйте положение пучка насоса через зеркало или смещение напряжения в программном обеспечении для визуализации. После оптимизации постоянного тока отрегулируйте зеркала луча Стокса до тех пор, пока сигнал переменного тока не будет максимизирован, отрегулировав пороговое значение для отображения примерно 50% насыщенности, проверяя, что насыщенность находится в центре изображения.
Если нет, тонкая настройка зеркал только в луче Стокса и мониторинг сигнала во время выравнивания в качестве обратной связи в режиме реального времени о качестве выравнивания. Для анализа SNR откройте программное обеспечение ImageJ и импортируйте сохраненный образец текстового файла DMSO, щелкнув Файл, затем Импорт, а затем параметры Текстовое изображение и Открыть из раскрывающегося меню. После импорта изображения нажмите клавишу Control Shift C, чтобы открыть функцию «Яркость и контрастность», затем нажмите кнопку «Авто» в функции «Яркость и контрастность», пока область образца DMSO не станет насыщенной, чтобы найти максимальный сигнал выборки.
Затем щелкните инструмент «Выделение овала» на интерфейсе ImageJ и выделите небольшую область насыщенной области DMSO. После выделения нажмите клавишу M, чтобы измерить среднее и стандартное отклонение выбранной области. Для измерения фона отрегулируйте полосы в функции «Яркость и контрастность» до тех пор, пока не будет наблюдаться сигнал пустой области, затем щелкните Овальную область и выделите область фона, убедившись, что выбранная область не содержит DMSO.
После этого нажмите клавишу M, чтобы измерить статистику выбранной области. Затем рассчитайте SNR, как показано ранее, путем измерения среднего значения шума и среднего значения сигнала вместе со стандартным отклонением. Чтобы обработать гиперспектральные изображения CRS, импортируйте текстовый файл, щелкнув в раскрывающемся меню параметры «Импорт», «Текстовое изображение» и «Открыть».
После импорта нажмите «Изображение», затем «Стеки», затем «Инструменты» и «Монтаж в стек», чтобы преобразовать файл в стек изображений, затем прокрутите монтаж, пока не будет виден первый пик DMSO. Выберите область в DMSO и нажмите «Изображение», а затем параметры «Стек» и «График профиля оси Z», чтобы отобразить интенсивность и спектр чисел кадров. Затем нажмите на Список и скопируйте данные профиля, чтобы извлечь необработанные спектральные данные.
Чтобы преобразовать восстановленный спектр в частотные единицы, выполните линейную регрессию с использованием симметричного и асимметричного CH, простирающегося от DMSO и соответствующих им номеров кадров. Спектральное разрешение DMSO было измерено с использованием гиперспектральной микроскопии SRS и CARS, которые показывают разрешение волнового числа 14,6 и 17,1 соответственно, что указывает на то, что SRS имеет лучшее спектральное разрешение. Спектры DMSO SRS были получены при концентрациях 0,1 и 0,01%, в которых пик при волновом числе 2913 может быть разрешен в первом, но не во втором, что указывает на то, что предел обнаружения составляет от 0,1 до 0,01% DMSO.
Фазовые спектры CARS показывают, что пик волнового числа DMSO 2913 может быть четко разрешен для 0,1% DMSO, но не 0,01%, указывающий на предел обнаружения между этими двумя концентрациями. Профили интенсивности SRS и CARS ячейки MIA PaCA-2 показали, что сигнал SRS дает разрешение 398,6 нанометра, в то время как сигнал CARS дает в 1,2 раза лучшее разрешение 330,3 нанометра. Изображения SRS и CARS из ячеек MIA PaCa-2 в разных положениях оптической задержки показывают самые сильные сигналы с липидными каплями в качестве ярких точек для SRS, тогда как CARS имеют значительно уменьшенные контрасты.
Тем не менее, красное смещение 37 волнового числа в спектральной фокусировке улучшило липидные контрасты как для SRS, так и для CARS. Спектры SRS показывают гораздо более сильный сигнал при волновом числе 2850 для липидных капель, чем другие органеллы, тогда как спектры CARS показывают небольшое красное смещение. Чтобы оптимизировать когерентный сигнал рассеяния комбинационного рассеяния, сначала найдите фокус образца, затем настройте оптическую задержку и, наконец, точно настройте зеркала до тех пор, пока не будет достигнут максимум.
Другие технологии насоса-зонда, такие как переходное поглощение, по своей сути интегрированы в платформу CRS. Эта технология очень мощная для измерения кинетики поглощения сильных светопоглощающих нефлуоресцентных молекул. Этот метод позволяет исследователям просматривать небольшие молекулы без меток с высокой химической активностью клеток.
Это также позволяет исследователям просматривать изменения в липидном обмене, внутриклеточной динамике и распределении лекарств.
