建立胰腺癌斑马鱼患者来源的异种移植物进行化学敏感性测试

斑马鱼患者来源的异种移植物是一种强大的临床前模型，用于预测癌症患者体内的化学敏感性特征。该协议描述了从患者手术标本开始的模型生成。通过异种移植小组织碎片而不是将细胞分离到斑马鱼胚胎中，可以维持肿瘤微环境，这是肿瘤进展和化疗反应的关键步骤。

该模型的最大优势在于它有可能在短短一周的临床相关时间范围内预测患者的预后，作为个性化医疗的工具。通过用五毫升新鲜肿瘤培养基洗涤从患者收集的整个肿瘤组织开始样品处理。使用塑料巴斯德移液器上下移液10次。

在重复洗涤三次之前，小心吸出并丢弃洗涤介质。将样品浸入一到两毫升新鲜肿瘤培养基中。使用手术刀刀片将肿瘤样本切成一到两毫米的立方体碎片，然后将它们放入装有肿瘤培养基的无菌五毫升塑料管中。

将McIlwain组织切碎器设置为100微米厚度后，将肿瘤碎片放在切碎器的圆形塑料台上并切碎。将桌子旋转 90 度并重复切碎。将切碎的肿瘤碎片收集在含有肿瘤培养基的15毫升塑料管中。

将切碎的肿瘤碎片以300G离心三分钟，然后吸出并丢弃上清液。将片段与细胞痕量溶液或替代荧光细胞追踪剂（如CM-DiI或深红）在37摄氏度的水浴中孵育30分钟。在孵育过程中，每10分钟轻轻重悬一次片段。

在染色结束时，通过添加补充至少1%蛋白质的肿瘤培养基来去除任何游离染料。体积将是染色体积的五倍。将碎片以300G离心三分钟，弃去上清液。

加入一毫升Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水或DPBS，并重复此洗涤步骤三次。完成后，将碎片悬浮在60毫米培养皿中的5毫升DPBS中。为了建立基于斑马鱼的患者来源的异种移植物或zPDX，麻醉受精后两天的胚胎。

在具有三个琼脂糖圆柱体的培养皿中，将斑马鱼胚胎放在露出一侧的圆柱体上。去除多余的溶液，将胚胎保持在薄膜中。使用无菌镊子，将染色的肿瘤组织碎片从60毫米培养皿转移到放置胚胎的1%琼脂糖载体中。

然后拿起组织并将其放在胚胎蛋黄上，然后使用热拉玻璃微针将其推入阴道空间。在胚胎中加入一些E3 1%青霉素链霉素，使其重新进入液体中。在所有胚胎中重复植入肿瘤组织后，从培养皿中取出琼脂糖载体并在35摄氏度下孵育胚胎。

植入后两小时，使用荧光体视显微镜检查胚胎是否有正确的染色阳性异种移植物。丢弃死胚胎和没有肿瘤碎片的胚胎完全在围膜空间内。完成后，将胚胎随机分布在六个多孔板中，根据实验计划平均分成几组。

通过将药物混合到E3 1%笔链球菌中来稀释药物，以制备FOLFOXIRI鸡尾酒。植入两个小时后，从每个孔中取出培养基并加入药物鸡尾酒。将胚胎放入35摄氏度的培养箱中三天，每天更换培养基以更新药物。

对于成像，在共聚焦显微镜的40X物镜下捕获图像。使用 1024 x 512 像素的分辨率，Z 间距为 5 微米。为分析氰基中检测到的细胞凋亡而采集的zPDX的整个安装图像显示，与对照组相比，联合治疗增加了细胞凋亡。

该案例研究报告称，与对照组相比，FOLFOXIRI治疗组的植入异种移植物中凋亡细胞的比例在统计学上显着增加。该协议显示了使用胰腺癌组织的一个例子，但斑马鱼患者来源的异种移植物可以从不同类型的癌症中建立。此外，由于该模型的伦理影响较小，因此很容易用于新药的体内筛选。

该方法在技术上具有挑战性，需要专业操作员。斑马鱼胚胎操作和显微注射方面的先前专业知识将加快该技术的培训。