Zebra balığı hasta kaynaklı ksenogref, kanser hastası kemosensitivite profilini in vivo olarak tahmin etmek için güçlü bir klinik öncesi modeldir. Protokol, bir hastanın cerrahi örneğinden başlayarak modelin oluşturulmasını tanımlar. Hücreleri zebra balığı embriyolarına izole etmek yerine küçük bir doku parçasını ksenografize ederek, tümör ilerlemesi ve kemoterapiye yanıt için çok önemli bir adım olan tümör mikro ortamını korumak mümkündür.
Modelin en büyük avantajı, hastanın prognozunu kişiselleştirilmiş tıp için bir araç olarak hareket eden sadece bir haftalık klinik ilgili bir zaman diliminde tahmin etme potansiyeli ile verilmektedir. Hastadan toplanan tüm tümör dokusunu beş mililitre taze tümör ortamı ile yıkayarak numune işlemeye başlayın. Plastik bir Pasteur pipet kullanarak 10 kez yukarı ve aşağı pipet yapın.
Yıkamayı üç kez tekrarlamadan önce yıkama ortamını dikkatlice aspire edin ve atın. Numuneyi bir ila iki mililitre taze tümör ortamına daldırın. Tümör örneğini bir neşter bıçağı kullanarak bir ila iki milimetrelik küp parçalarına bölün ve ardından tümör ortamına sahip steril beş mililitrelik plastik bir tüpe yerleştirin.
McIlwain Doku Doğrayıcıyı 100 mikrometre kalınlığa ayarladıktan sonra, tümör parçalarını doğrayıcının dairesel plastik masasına yerleştirin ve doğrayın. Masayı 90 derece döndürün ve doğrama işlemini tekrarlayın. Doğranmış tümör parçalarını, tümör ortamını içeren 15 mililitrelik plastik bir tüpte toplayın.
Doğranmış tümör parçalarını, süpernatanı aspire etmeden ve atmadan önce üç dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Parçaları hücre izi çözeltisiyle veya CM-DiI veya Deep Red gibi alternatif bir floresan hücre izleyici ile 37 santigrat derecelik bir su banyosunda 30 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçka sırasında, parçaları her 10 dakikada bir yavaşça askıya alın.
Boyamanın sonunda, en az% 1 protein ile takviye edilmiş bir tümör ortamı ekleyerek herhangi bir serbest boyayı çıkarın. Hacim, boyama hacminin beş katı olacaktır. Parçaları üç dakika boyunca 300 G'de santrifüj edin ve süpernatanı atın.
Bir mililitre Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin veya DPBS ekleyin ve bu yıkama adımını üç kez tekrarlayın. İşiniz bittiğinde, parçaları 60 milimetrelik bir Petri kabında beş mililitre DPBS'de askıya alın. Zebra balığı bazlı hasta kaynaklı ksenogreftleri veya zPDX'i oluşturmak için, döllenmeden sonraki iki gün embriyoları uyuşturun.
Üç agaroz silindirine sahip bir Petri kabında, bir tarafı açığa çıkan bir silindir üzerine bir zebra balığı embriyosu koyun. Embriyoyu ince bir filmde tutmak için fazla çözeltiyi çıkarın. Steril forseps kullanarak, lekeli tümör dokusu parçalarının parçasını 60 milimetrelik bir Petri kabından embriyonun yerleştirildiği %1 agaroz desteğine aktarın.
Daha sonra dokuyu alın ve ısıdan çekilen cam mikroiğneyi kullanarak perivitelin boşluğuna itmeden önce embriyo sarısına yerleştirin. Sıvıya geri getirmek için embriyoya birkaç damla E3% 1% penisilin streptomisin ekleyin. Tüm embriyolarda tümör dokusunun implantasyonunu tekrarladıktan sonra, agaroz desteklerini Petri kabından çıkarın ve embriyoları 35 santigrat derecede inkübe edin.
İmplantasyondan iki saat sonra, floresan stereo mikroskop kullanarak embriyoları pozitif boyama ile doğru ksenogreftler için kontrol edin. Ölü embriyoları ve tümör parçaları olmayan embriyoları tamamen perivitelin boşluğuna atın. Bir kez yapıldıktan sonra, embriyoları deneysel plana göre eşit olarak gruplara ayrılmış altı çok kuyucuklu plakaya rastgele dağıtın.
FOLFOXIRI kokteylini hazırlamak için ilaçları E3% 1 pen-strep içine karıştırarak seyreltin. İki saatlik implantasyondan sonra, medyayı her bir kuyucuktan çıkarın ve ilaç kokteylini ekleyin. İlaçları yenilemek için embriyoları, ortamın günlük değişiklikleriyle üç gün boyunca 35 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin.
Görüntüleme için, konfokal mikroskobun 40X hedefi altında görüntüler yakalayın. Beş mikrometrelik bir Z aralığıyla 1024 x 512 piksel çözünürlüğü kullanın. Siyanoda saptanan apoptozu analiz etmek için elde edilen zPDX'lerin tüm montaj görüntüleri, kombine tedavinin kontrol grubu grubuna kıyasla hücre apoptozunu arttırdığını göstermiştir.
Vaka çalışması, implante edilmiş ksenogreftlerdeki apoptotik hücrelerin fraksiyonunda, FOLFOXIRI ile tedavi edilen grup için kontrol grubuna kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir artış tespit edildiğini bildirmiştir. Protokol, pankreas kanseri dokusunu kullanan bir örnek göstermektedir, ancak zebra balığı hasta kaynaklı ksenogreftler farklı kanser türlerinden oluşturulabilir. Ek olarak, model düşük bir etik etkiye sahip olduğundan, yeni ilaçların in vivo taraması için kolayca kullanılabilir.
Yöntem teknik olarak zordur ve uzman bir operatör gerektirir. Zebra balığı embriyo manipülasyonu ve mikroenjeksiyonunda önceden uzmanlık sahibi olmak, tekniğin eğitimini hızlandıracaktır.
