يعد xenograft المشتق من مريض الزرد نموذجا قويا قبل السريري للتنبؤ بملف الحساسية الكيميائية لمرضى السرطان في الجسم الحي. يصف البروتوكول جيل النموذج بدءا من عينة جراحية للمريض. من خلال تطعيم جزء صغير من الأنسجة بدلا من عزل الخلايا في أجنة الزرد ، من الممكن الحفاظ على البيئة المكروية للورم وهي الخطوة الحاسمة لتطور الورم والاستجابة للعلاج الكيميائي.
يتم إعطاء الميزة الكبيرة للنموذج من خلال قدرته على التنبؤ بتشخيص المريض في إطار زمني سريري ذي صلة مدته أسبوع واحد فقط يعمل كأداة للطب الشخصي. ابدأ معالجة العينة عن طريق غسل أنسجة الورم بأكملها التي تم جمعها من المريض بخمسة ملليلتر من وسط الورم الطازج. ماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات باستخدام ماصة باستور البلاستيكية.
قم بشفط وسط الغسيل بعناية والتخلص منه قبل تكرار الغسيل ثلاث مرات. اغمر العينة في واحد إلى ملليلتر من وسط الورم الطازج. قطع عينة الورم إلى قطعة مكعبة من واحد إلى اثنين ملليمتر باستخدام شفرة مشرط ، ثم ضعها في أنبوب بلاستيكي معقم سعة خمسة ملليلتر مع وسط الورم.
بعد ضبط مفرمة الأنسجة McIlwain على سمك 100 ميكرومتر ، ضع قطع الورم على الطاولة البلاستيكية الدائرية للمروحية واقطعها. قم بتدوير الطاولة بمقدار 90 درجة وكرر التقطيع. اجمع شظايا الورم المفرومة في أنبوب بلاستيكي سعة 15 ملليلتر يحتوي على وسط الورم.
أجهزة الطرد المركزي شظايا الورم المفروم عند 300 غرام لمدة ثلاث دقائق قبل شفط والتخلص من المادة الطافية. احتضن الشظايا بمحلول تتبع الخلية أو بتعقب الخلايا الفلورية البديلة مثل CM-DiI أو Deep Red لمدة 30 دقيقة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. أثناء الحضانة ، أعد تعليق الشظايا برفق كل 10 دقائق.
في نهاية التلوين ، قم بإزالة أي صبغة مجانية عن طريق إضافة وسط ورم مكمل بما لا يقل عن 1 ٪ من البروتين. سيكون الحجم خمسة أضعاف حجم التلطيخ. أجهزة الطرد المركزي شظايا في 300 G لمدة ثلاث دقائق وتجاهل طاف.
أضف ملليلترا واحدا من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco أو DPBS وكرر خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتعليق الشظايا في خمسة ملليلتر من DPBS في طبق بتري 60 ملم. لإنشاء الطعوم الخارجية المشتقة من المريض أو zPDX القائمة على الزرد ، قم بتخدير الأجنة بعد يومين من الإخصاب.
في طبق بتري يحتوي على ثلاث أسطوانات أغاروز ، ضع جنين الزرد على أسطوانة تعرض جانبا واحدا. قم بإزالة المحلول الزائد للحفاظ على الجنين في طبقة رقيقة. باستخدام ملقط معقم ، انقل قطعة شظايا أنسجة الورم الملطخة من طبق بتري 60 ملم إلى دعم 1٪ من الأغاروز حيث يتم وضع الجنين.
ثم التقط المنديل وضعه على صفار الجنين قبل دفعه إلى الفضاء المحيط باستخدام الإبرة الزجاجية الدقيقة المسحوبة بالحرارة. أضف بعض قطرات E3 1٪ البنسلين ستربتومايسين إلى الجنين لإعادته إلى السائل. بعد تكرار زرع أنسجة الورم في جميع الأجنة ، قم بإزالة دعامات الأغاروز من طبق بتري واحتضان الأجنة عند 35 درجة مئوية.
بعد ساعتين من الزرع ، افحص الأجنة بحثا عن الطعوم الخارجية الصحيحة مع تلطيخ إيجابي باستخدام مجهر ستيريو فلوري. تخلص من الأجنة الميتة والأجنة بدون شظايا الورم تماما داخل الفضاء المحيطي. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتوزيع الأجنة بشكل عشوائي في ست لوحات متعددة الآبار ، مقسمة بالتساوي إلى مجموعات وفقا للخطة التجريبية.
قم بتخفيف الأدوية عن طريق مزجها في E3 1٪ pen-strep لتحضير كوكتيل FOLFOXIRI. بعد ساعتين من الزرع ، قم بإزالة الوسائط من كل بئر وأضف كوكتيل الدواء. ضع الأجنة في الحاضنة عند 35 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام مع تغييرات يومية للوسط لتجديد الأدوية.
للتصوير ، التقط صورا تحت هدف 40X من المجهر متحد البؤر. استخدم دقة 1024 × 512 بكسل مع تباعد Z يبلغ خمسة ميكرومترات. أظهرت صور التركيب الكاملة ل zPDXs التي تم الحصول عليها لتحليل موت الخلايا المبرمج المكتشف في cyano أن العلاج المشترك زاد من موت الخلايا المبرمج مقارنة بمجموعة المجموعة الضابطة.
ذكرت دراسة الحالة أنه تم تحديد زيادة ذات دلالة إحصائية في جزء الخلايا المبرمج في الطعوم الخارجية المزروعة للمجموعة المعالجة ب FOLFOXIRI مقارنة بالمجموعة الضابطة. يظهر البروتوكول مثالا على استخدام أنسجة سرطان البنكرياس ، ولكن يمكن إنشاء الطعوم الخارجية المشتقة من مريض الزرد من أنواع مختلفة من السرطان. بالإضافة إلى ذلك ، نظرا لأن النموذج له تأثير أخلاقي منخفض ، فإنه يمكن استغلاله بسهولة للفحص في الجسم الحي للعقاقير الجديدة.
هذه الطريقة صعبة من الناحية الفنية وتتطلب مشغلا خبيرا. الخبرة السابقة في معالجة أجنة الزرد والحقن المجهري ستسرع من تدريب هذه التقنية.
