Zebrafish 환자 유래 이종이식편은 생체 내에서 암 환자의 화학민감도 프로필을 예측하는 강력한 전임상 모델입니다. 이 프로토콜은 환자 수술 표본에서 시작하는 모델의 생성을 설명합니다. 세포를 제브라피쉬 배아로 분리하는 대신 작은 조직 조각을 이종이식함으로써 종양 진행 및 화학 요법에 대한 반응에 중요한 단계인 종양 미세 환경을 유지할 수 있습니다.
이 모델의 가장 큰 장점은 단 1주일의 임상 관련 기간 내에 환자의 예후를 예측할 수 있는 잠재력이 있어 개인화된 의학을 위한 도구 역할을 한다는 것입니다. 환자로부터 채취한 전체 종양 조직을 5밀리리터의 신선한 종양 배지로 세척함으로써 샘플 처리를 시작한다. 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 위아래로 10번 피펫팅합니다.
세척을 세 번 반복하기 전에 세척 매체를 조심스럽게 흡인하고 폐기하십시오. 샘플을 1-2 밀리리터의 신선한 종양 배지에 담그십시오. 메스 블레이드를 사용하여 종양 샘플을 1-2 밀리미터 큐브 조각으로 자른 다음 종양 배지가있는 멸균 된 5 밀리리터 플라스틱 튜브에 넣습니다.
McIlwain Tissue Chopper를 100마이크로미터 두께로 설정한 후 종양 조각을 초퍼의 원형 플라스틱 테이블에 놓고 자릅니다. 테이블을 90도 회전하고 자르기를 반복하십시오. 종양 배지가 들어 있는 15밀리리터 플라스틱 튜브에 잘게 잘린 종양 조각을 수집합니다.
잘게 잘린 종양 단편을 300G에서 3분 동안 원심분리한 후 상층액을 흡인하고 버립니다. 세포 추적 용액 또는 CM-DiI 또는 Deep Red와 같은 대체 형광 세포 추적기를 사용하여 섭씨 37도의 수조에서 30분 동안 절편을 배양합니다. 배양하는 동안 10 분마다 조각을 부드럽게 다시 일시 중단하십시오.
염색이 끝나면 단백질의 1 % 이상이 보충 된 종양 배지를 추가하여 유리 염료를 제거합니다. 부피는 염색 부피의 5배가 됩니다. 300G에서 3분 동안 조각을 원심분리하고 상층액을 버립니다.
Dulbecco의 인산염 완충 식염수 또는 DPBS 1밀리리터를 추가하고 이 세척 단계를 세 번 반복합니다. 완료되면 60mm 페트리 접시에 5 밀리리터의 DPBS에 조각을 매달아 놓습니다. 제브라피쉬 기반 환자 유래 이종이식 또는 zPDX를 확립하려면 수정 후 이틀 동안 배아를 마취합니다.
3 개의 agarose 실린더가있는 페트리 접시에서 한쪽면을 노출시키는 실린더에 제브라 피쉬 배아를 놓습니다. 배아를 박막에 보관하기 위해 과잉 용액을 제거하십시오. 멸균 집게를 사용하여 염색된 종양 조직 조각 조각을 60mm 페트리 접시에서 배아가 놓이는 1% 아가로스 지지대로 옮깁니다.
그런 다음 조직을 집어 배아 노른자 위에 올려 놓은 후 열 당김 유리 미세 바늘을 사용하여 perivitelline 공간으로 밀어 넣습니다. 배아에 E3 1% 페니실린 스트렙토마이신 몇 방울을 넣어 액체로 다시 가져옵니다. 모든 배아에서 종양 조직의 이식을 반복 한 후, 페트리 접시에서 아가로스 지지체를 제거하고 섭씨 35도에서 배아를 배양한다.
이식 2시간 후, 형광 실체 현미경을 사용하여 양성 염색으로 배아에 올바른 이종이식이 있는지 확인합니다. 죽은 배아와 종양 조각이 없는 배아는 perivitelline 공간 내부에 완전히 폐기하십시오. 완료되면 배아를 6 개의 멀티 웰 플레이트에 무작위로 분배하고 실험 계획에 따라 그룹으로 균등하게 나눕니다.
약물을 E3 1%pen-strep에 혼합하여 희석하여 FOLFOXIRI 칵테일을 준비합니다. 이식 2 시간 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 약물 칵테일을 첨가하십시오. 배아를 섭씨 35도의 인큐베이터에 3일 동안 넣고 배지를 매일 교체하여 약물을 갱신합니다.
이미징의 경우 컨포칼 현미경의 40X 대물렌즈로 이미지를 캡처합니다. 1024 x 512 픽셀의 해상도와 Z 간격이 5마이크로미터인 것을 사용합니다. 시아노에서 검출된 세포자멸사를 분석하기 위해 획득한 zPDXs의 전체 마운트 이미지는 병용 요법이 대조군에 비해 세포 사멸을 증가시키는 것으로 나타났다.
사례 연구는 이식된 이종이식에서 세포사멸 세포 비율의 통계적으로 유의미한 증가가 대조군에 비해 FOLFOXIRI 처리군에서 확인되었다고 보고했습니다. 이 프로토콜은 췌장암 조직을 사용하는 예를 보여 주지만 제브라 피쉬 환자 유래 이종 이식편은 다른 유형의 암에서 확립 될 수 있습니다. 또한, 이 모델은 윤리적 영향이 낮기 때문에 신약의 생체 내 스크리닝에 쉽게 활용될 수 있습니다.
이 방법은 기술적으로 까다롭고 전문 작업자가 필요합니다. 제브라피쉬 배아 조작 및 미세 주입에 대한 사전 전문 지식은 기술 교육을 가속화할 것입니다.
