该协议扩展了用于再生研究的非常常见的划痕伤口测定，代表小肠所有主要细胞类型的肠来源单层。该技术能够在肠再生的早产2D肠样单层模型中实时可视化伤口闭合。我们的技术可以应用于早产哺乳动物肠道的研究，通常使用转化的结直肠癌细胞系进行不良建模。
首先在冰上解冻96微升细胞外基质或基于ECM的水凝胶BME，在2至8摄氏度的冰上过夜。以1：50的比例稀释基于ECM的水凝胶和不含钙或镁的冰冷PBS。用200微升冰冷稀释的基于ECM的水凝胶涂覆24孔组织培养板的每个孔，并将包被板在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育至少一小时。
然后从含有用于单层的3D类肠的24孔培养板中吸出培养基，并用每孔500微升细胞解离试剂替换它。通过上下移液 8 到 12 次并将 12 个孔的内容物转移到 15 毫升锥形管中，手动破坏基于 ECM 的水凝胶圆顶。用250微升细胞解离试剂洗涤12个空孔，以确保已去除所有肠样，并将内容物转移到15毫升锥形管中。
将锥形管在 300g 的温度下在 4 摄氏度下离心五分钟，然后弃去上清液。向锥形管中加入 10 毫升冰冷的 DMEM/F-12 洗涤缓冲液，并通过倒置管悬浮肠样颗粒。在4摄氏度下以300g离心5分钟，然后除去上清液。
将细胞沉淀重悬于12毫升37摄氏度胰蛋白酶-EDTA中，并将试管置于37摄氏度的水浴中10分钟或直到细胞看起来可溶。向每个试管中加入三毫升 DMEM/F-12 洗涤缓冲液以稀释胰蛋白酶-EDTA。倒置试管混合并放在冰上。
通过37微米网状细胞过滤器过滤解离的肠。将内容物收集到干净的 15 毫升锥形管中，并在 4 摄氏度下以 300g 离心管五分钟。从锥形管中取出上清液，并用六毫升HOMGY重悬细胞沉淀。
接下来，从培养箱中取出基于ECM的水凝胶涂层板，并吸出任何多余的基于ECM的水凝胶溶液，而不会划伤涂层表面或完全干燥板。将500微升合并的12毫升HOMGY细胞悬液加入涂有ECM基水凝胶的24孔板的每个孔中。用盖子旋转板以确保孔内细胞均匀分布。
将板在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育，每两天更换一次HOMGY培养基，直到单层达到大于90%的汇合度。一旦单层达到大于90%汇合度，吸出培养基以去除任何无法附着的细胞。用溶解在HOMGY中的500微升HA35或PBS处理细胞24小时。
之后，在不破坏单层表面的情况下取出介质。使用200微升移液器吸头，在每个孔中单层的整个表面直径上划伤，注意不要让单层干燥。用500微升1X PBS清洗划伤的单层一次，并加入500微升溶解在HOMGY中的HA35或PBS。
将板转移到37摄氏度和5%二氧化碳培养箱内的活细胞分析仪器上。在活细胞分析软件中的计划图标下，单击启动添加新容器向导图标。选择按计划扫描，然后单击下一步。
在创建容器下选择新建并单击下一步，然后在扫描类型下选择整井并单击下一步。为图像通道选择相位，为物镜选择4倍。从提供的列表中选择印版制造商和目录号，然后单击下一步。
选择一个空容器位置，然后选择所需的扫描模式。在“名称”中输入板名称，然后选择加号以创建板布局。选择“小加号”以创建治疗名称。
输入短名称，然后输入确定。突出显示与该处理相对应的板孔，并点击大加号以指定具有该处理的孔。输入化合物浓度，然后单击确定。板完成后，选择“确定”、“下一步”。选择“将分析推迟到以后”，然后选择“每隔 4 小时创建扫描的新计划”。
在一天零小时停止扫描。确保摘要正确，然后添加到计划。在活细胞分析软件中，选择屏幕顶部的“查看”。
从“容器名称”菜单中，导航到已完成的 24 小时扫描，然后双击容器名称。选择左侧的导出图像和动画图标，然后选择显示的选项。突出显示感兴趣的井，然后选择感兴趣的时间点和显示的图像系列。
确保序列类型和扫描正确。选择所需的目标文件夹位置。从下拉菜单中选择 JPEG，然后选择导出。
打开 ImageJ 软件并上传划痕伤口测定图像。选择“图像”，然后键入 8 位以将图像从 24 位 RGB 更改为图像。选择插件、宏、安装Wound_healing_size插件以安装伤口愈合大小插件。
之后，将方差窗口半径设置为 20，阈值设置为 100，饱和像素百分比设置为 0.001。是 对于设置全局比例，然后单击确定。验证轮廓区域是否为伤口区域，并重复其他划痕。最后，使用屏幕上显示的方程式计算24小时内迁移或增殖细胞的划痕区域伤口愈合百分比。
此处，T0 是零小时的区域，TC 是零小时、4 小时、12 小时或 24 小时的区域。这些图像显示了肠样生成和肠源性单层伤口愈合测定程序。三维非人灵长类肠的培养物用于解离成二维单层。
将单层在24孔板中生长至大于90%汇合度，然后用HA35或PBS处理24小时。然后用P200移液器吸头刮擦单层。这里显示的是HA35在非人灵长类肠样单层对照治疗中的代表性图像。
在使用P200移液器吸头进行划痕后的零小时，4小时，12小时和24小时获得图像。此处显示了HA35对伤口愈合和样单层膜的影响。肠样单层伤口愈合随时间的变化取决于HA35治疗浓度。
与对照组相比，HA35在100微克/毫升和200微克/毫升下在4小时和12小时后显着增加了伤口愈合，但愈合率在24小时内在治疗之间趋同。在这个过程中要记住的最重要的事情之一是肠样单层是短暂的。因此，一旦它们达到90%的流体，研究人员应该寻求快速使用它们。
这项技术已成为我们体外早产肠道再生的首选模型，特别是如果我们对更多的机械性而不是炎症性损伤感兴趣。
