Этот протокол расширяет очень распространенный анализ царапин, используемый для исследований регенерации, монослоями энтероидного происхождения, представляющими все основные типы клеток тонкой кишки. Этот метод позволяет в режиме реального времени визуализировать закрытие раны в преждевременной 2D энтероидной монослойной модели регенерации кишечника. Наша методика может быть применена для изучения кишечника недоношенных млекопитающих, который, как правило, плохо моделируется с использованием трансформированных линий клеток колоректального рака.
Начните с размораживания 96 микролитров внеклеточного матрикса или гидрогеля BME на основе ECM в течение ночи на льду при температуре от двух до восьми градусов цельсия. Разбавить гидрогель на основе ECM и ледяной PBS без кальция или магния в соотношении один к 50. Покройте каждую скважину 24-луночной пластиной для культивирования тканей 200 микролитрами ледяного разбавленного гидрогеля на основе ECM и инкубируйте покрытую пластину в течение как минимум одного часа при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Затем аспирируют среду из 24-луночной культуральной пластины, содержащей 3D-энтероиды, предназначенные для монослоев, и заменяют ее 500 микролитрами реагента диссоциации клеток на лунку. Вручную разрушают купола гидрогеля на основе ECM путем пипетки вверх и вниз от восьми до 12 раз и переноса содержимого 12 скважин в 15-миллилитровую коническую трубку. Промыть 12 пустых лунок 250 микролитрами реагента диссоциации клеток, чтобы убедиться, что все энтероиды удалены, и перенесите содержимое в 15-миллилитровые конические трубки.
Центрифугируйте конические трубки при 300 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте супернатант. Добавьте 10 миллилитров ледяного буфера DMEM/F-12 в конические трубки и суспендируйте энтероидные гранулы, перевернув трубки. Центрифугировать при 300 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и удалить супернатант.
Повторно суспендируйте клеточные гранулы в 12 миллилитрах 37 градусов Цельсия Трипсина-ЭДТА и поместите трубки в водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия на 10 минут или до тех пор, пока клетки не появятся растворимыми. Добавьте три миллилитра промывочного буфера DMEM/F-12 в каждую трубку, чтобы разбавить трипсин-ЭДТА. Перемешать, перевернув трубки и поместить на лед.
Фильтруйте диссоциированные энтероиды через 37-микрометровый сетчатый клеточный сетчатый фильтр. Соберите содержимое в чистые 15-миллилитровые конические трубки и центрифугируйте трубки по 300 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Удалите супернатант из конических трубок и повторно суспендируйте гранулы клеток шестью миллилитрами HOMGY.
Затем удалите пластину с гидрогелевым покрытием на основе ECM из инкубатора и аспирируйте любой избыток раствора гидрогеля на основе ECM, не царапая поверхность с покрытием или полностью высушивая пластину. Добавьте 500 микролитров комбинированной 12-миллилитров клеточной суспензии HOMGY в каждую лунку 24-луночной пластины, покрытой гидрогелем на основе ECM. Закрутите пластину с крышкой, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек внутри скважин.
Инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа, обменивая среды HOMGY каждые два дня, пока монослои не достигнут слияния более 90%. Как только монослои достигнут слияния более 90%, аспирируйте среду, чтобы удалить любые клетки, не способные прикрепиться. Обработайте клетки 500 микролитрами HA35 или PBS, растворенными в HOMGY в течение 24 часов.
После этого удалите носитель, не нарушая поверхность монослоя. Используя 200-микролитровый наконечник пипетки, сделайте линейную царапину по всему диаметру поверхности монослоя в каждом колодце, стараясь не дать монослоям высохнуть. Вымойте поцарапанные монослои один раз 500 микролитрами 1X PBS и добавьте 500 микролитров HA35 или PBS, растворенных в HOMGY.
Перенесите пластину на прибор для анализа живых клеток в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Под значком Расписание в программном обеспечении для анализа живых клеток щелкните значок Launch Add New Vessel Wizard (Мастер добавления нового судна). Выберите «Сканировать по расписанию», затем нажмите «Далее».
Выберите «Создать» в разделе «Создать судно» и нажмите «Далее», затем выберите «Вся скважина» в разделе «Тип сканирования» и нажмите «Далее». Выберите Фаза для каналов изображения и 4x для цели. Выберите производителя пластины и каталожный номер из предоставленного списка и нажмите кнопку Далее.
Выберите местоположение пустого сосуда, а затем требуемый шаблон сканирования. Введите имя пластины в поле Имя, затем выберите плюс, чтобы создать макет пластины. Выберите маленький плюс, чтобы создать имя процедуры.
Введите краткое имя и нажмите кнопку ОК. Выделите пластинчатые колодцы, соответствующие этой обработке, и нанесите большой плюс, чтобы обозначить колодцы с этой обработкой. Введите концентрацию соединения и нажмите кнопку ОК. Когда пластина будет готова, нажмите кнопку ОК, Далее. Выберите Отложить анализ до позднего времени, а затем Создать новое расписание со сканированием с интервалом в четыре часа.
Прекратите сканирование в один день, ноль часов. Убедитесь, что сводка верна, а затем добавьте в расписание. В программном обеспечении для анализа живых клеток выберите Вид в верхней части экрана.
В меню Название судна перейдите к завершенному 24-часовому сканированию и дважды щелкните название судна. Выберите Значок Экспортировать изображения и фильмы слева, а затем параметр Как отображается. Выделите интересующие вас колодцы, а затем выберите точки интереса по времени и Серию изображений в том виде, в котором они отображаются.
Убедитесь, что тип последовательности и сканы верны. Выберите требуемое расположение целевой папки. Выберите JPEG в раскрывающемся меню, а затем Экспорт.
Откройте программное обеспечение ImageJ и загрузите изображение анализа царапины. Выберите Изображение, затем введите 8-бит, чтобы изменить изображение с 24-битного RGB. Выберите Плагины, Макросы, Установить, Wound_healing_size плагин, чтобы установить Плагин Размера Заживления Ран.
После этого установите радиус окна дисперсии равным 20, пороговое значение 100, процент насыщенных пикселей 0,001. Да, для параметра Установить глобальное масштабирование, а затем нажмите кнопку ОК. Убедитесь, что очерченная область является областью раны, и повторите для дополнительных царапин. Наконец, рассчитайте процент заживления раны в области царапин мигрирующих или пролиферирующих клеток в течение 24 часов, используя уравнение, показанное на экране.
Здесь T0 — это область в нулевое время, а TC — это область в ноль часов, четыре часа, 12 часов или 24 часа. На этих изображениях показаны энтероидная генерация и процедура заживления ран энтероидного происхождения. Культура трехмерных, нечеловеческих кишечных энтероидов приматов используется для диссоциации на двумерные монослои.
Монослои выращивали до более чем 90% слияния в 24-луночной пластине, а затем обрабатывали HA35 или PBS в течение 24 часов. Затем монослои были поцарапаны наконечником пипетки P200. Здесь показаны репрезентативные изображения HA35 в контрольных методах лечения энтероидных монослоев нечеловеческих приматов.
Изображения были получены через ноль часов, четыре часа, 12 часов и 24 часа после выполнения царапины наконечником пипетки P200. Здесь показано влияние HA35 на ранозаживляющие андоидные монослои. Изменение заживления ран с течением времени в энтероидных монослоях зависит от концентрации лечения HA35.
HA35 значительно увеличивал заживление ран через четыре часа и 12 часов при 100 микрограммах на миллилитр и 200 микрограммах на миллилитр по сравнению с контролем, но показатели заживления сошлись среди методов лечения на 24 часа. Одна из самых важных вещей, которые следует помнить при этой процедуре, заключается в том, что кишечные энтероидные монослои недолговечны. Таким образом, как только они на 90% объединены, исследователи должны стремиться использовать их быстро.
Этот метод стал нашей моделью для преждевременной кишечной регенерации in vitro, особенно если мы заинтересованы в более механической, а не воспалительной травме.
