이 프로토콜은 소장의 모든 주요 세포 유형을 나타내는 장내 유래 단분자층을 사용한 재생 연구에 사용되는 매우 일반적인 스크래치 상처 분석을 확장합니다. 이 기술은 장 재생의 조기 2D 장내 단층 모델에서 상처 봉합의 실시간 시각화를 가능하게 합니다. 우리의 기술은 일반적으로 형질 전환 된 대장 암 세포주를 사용하여 제대로 모델링되지 않은 조산 포유류 장 연구에 적용될 수 있습니다.
96 마이크로 리터의 세포 외 기질 또는 ECM 기반 하이드로 겔 BME를 섭씨 2도에서 8 도의 얼음에서 밤새 해동하여 시작하십시오. ECM 기반 하이드로겔과 얼음처럼 차가운 PBS를 칼슘이나 마그네슘 없이 1:50의 비율로 희석합니다. 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰을 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 희석 ECM 기반 하이드로겔로 코팅하고 코팅된 플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 최소 1시간 동안 배양합니다.
그런 다음 단층으로 향하는 3D 엔테로이드가 들어 있는 24웰 배양 플레이트에서 배지를 흡입하고 웰당 500마이크로리터의 세포 해리 시약으로 교체합니다. ECM 기반 하이드로겔 돔을 8-12회 위아래로 피펫팅하고 12웰의 내용물을 15밀리리터 원추형 튜브로 옮겨 수동으로 파괴합니다. 12개의 빈 웰을 250마이크로리터의 세포 해리 시약으로 세척하여 모든 엔터로이드가 제거되었는지 확인하고 내용물을 15밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.
원뿔형 튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 300g으로 원심분리하고 상층액을 버립니다. 원추형 튜브에 얼음처럼 차가운 DMEM/F-12 세척 버퍼 10ml를 추가하고 튜브를 뒤집어 장내 펠릿을 매달아 놓습니다. 섭씨 4도에서 5분 동안 300g에서 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
세포 펠릿을 섭씨 37도 트립신-EDTA 12밀리리터에 재현탁하고 튜브를 섭씨 37도의 수조에 10분 동안 또는 세포가 용해될 때까지 두십시오. 트립신-EDTA를 희석하기 위해 각 튜브에 DMEM/F-12 세척 완충액 3밀리리터를 추가합니다. 튜브를 뒤집어 섞고 얼음 위에 놓습니다.
해리된 엔테로이드를 37마이크로미터 메쉬 셀 스트레이너를 통해 여과합니다. 내용물을 깨끗한 15밀리리터 원추형 튜브에 모으고 섭씨 4도에서 5분 동안 300g의 튜브를 원심분리합니다. 원추형 튜브에서 상청액을 제거하고 6 밀리리터의 HOMGY로 세포 펠릿을 재현 탁하십시오.
다음으로, 인큐베이터로부터 ECM계 하이드로겔 코팅판을 제거하고 코팅된 표면을 긁거나 플레이트를 완전히 건조시키지 않고 임의의 과량의 ECM계 하이드로겔 용액을 흡인한다. 500마이크로리터의 결합된 12밀리리터 HOMGY 세포 현탁액을 ECM 기반 하이드로겔로 코팅된 24웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 웰 내에서 세포가 고르게 분포되도록 뚜껑을 덮고 플레이트를 소용돌이칩니다.
플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 배양하고 단층이 90% 컨플루언시 이상에 도달할 때까지 이틀마다 HOMGY 배지를 교환합니다. 단층이 90% 컨플루언시 이상에 도달하면 배지를 흡인하여 부착에 실패한 세포를 제거합니다. 세포를 HOMGY에 용해된 500 마이크로리터의 HA35 또는 PBS로 24시간 동안 처리한다.
그런 다음 단층의 표면을 방해하지 않고 미디어를 제거하십시오. 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 단층이 마르지 않도록 주의하면서 각 웰에 있는 단층의 전체 표면 직경에 걸쳐 선형 스크래치를 만듭니다. 긁힌 단분자층을 500마이크로리터의 1X PBS로 한 번 세척하고 HOMGY에 용해된 500마이크로리터의 HA35 또는 PBS를 추가합니다.
플레이트를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소 인큐베이터 내의 라이브 셀 분석 기기로 옮깁니다. 라이브 셀 분석 소프트웨어의 일정 아이콘 아래에서 새 선박 추가 마법사 시작 아이콘을 클릭합니다. 일정에 따라 검사를 선택하고 다음을 클릭합니다.
용기 생성에서 새로 만들기를 선택하고 다음을 클릭한 다음, 스캔 유형에서 전체 웰을 선택하고 다음을 클릭합니다. 이미지 채널로 위상을 선택하고 목표물에 4x를 선택합니다. 제공된 목록에서 플레이트 제조업체와 카탈로그 번호를 선택하고 다음을 클릭합니다.
빈 용기 위치를 선택한 다음 원하는 스캔 패턴을 선택합니다. 이름에 플레이트 이름을 입력한 다음, 더하기를 선택하여 플레이트 레이아웃을 만듭니다. 작은 더하기를 선택하여 처리 이름을 만듭니다.
ID 이름을 입력한 다음 확인을 입력합니다. 해당 처리에 해당하는 플레이트 웰을 강조 표시하고 큰 플러스를 눌러 해당 처리로 웰을 지정합니다. 화합물 농도를 입력하고 확인을 클릭합니다. 플레이트가 완료되면 확인, 다음을 선택합니다. 나중까지 분석 연기를 선택한 다음 4시간 간격으로 스캔하여 새 일정 만들기를 선택합니다.
1일, 0시간에 스캔을 중지합니다. 요약이 올바른지 확인한 다음 일정에 추가합니다. 라이브 셀 분석 소프트웨어에서 화면 상단의 보기를 선택합니다.
선박 이름 메뉴에서 완료된 24시간 스캔으로 이동하여 선박 이름을 두 번 클릭합니다. 왼쪽의 이미지 및 동영상 내보내기 아이콘을 선택한 다음 표시된 대로 옵션을 선택합니다. 관심 있는 우물을 강조 표시한 다음 관심 있는 시점과 표시된 이미지 시리즈를 선택합니다.
시퀀스 유형과 스캔이 올바른지 확인합니다. 원하는 대상 폴더 위치를 선택합니다. 드롭다운 메뉴에서 JPEG를 선택한 다음 내보내기를 선택합니다.
ImageJ 소프트웨어를 열고 스크래치 상처 분석 이미지를 업로드합니다. 이미지를 선택한 다음 8비트를 입력하여 이미지를 24비트 RGB에서 변경합니다. 플러그인, 매크로, 설치 Wound_healing_size 플러그인을 선택하여 상처 치유 크기 플러그인을 설치합니다.
그런 다음 분산 창 반경을 20으로, 임계값을 100으로, 포화 픽셀의 백분율을 0.001로 설정합니다. 예, 스케일 전역 설정에 대해 확인한 다음 확인을 클릭합니다. 윤곽이 있는 영역이 상처 영역인지 확인하고 추가 스크래치에 대해 반복합니다. 마지막으로, 화면에 표시된 방정식을 사용하여 24시간 동안 이동 또는 증식하는 세포의 스크래치 영역 상처 치유의 백분율을 계산합니다.
여기서, T0는 0시간에서의 면적이고, TC는 0시간, 4시간, 12시간, 또는 24시간에서의 면적이다. 엔테로이드 생성 및 엔테로이드 유래 단일층 상처 치유 분석 절차가 이 이미지에 나와 있습니다. 3 차원, 인간이 아닌 영장류 장 장내 장내 배양은 2 차원 단층으로 해리하는 데 사용됩니다.
단층은 24-웰 플레이트에서 90% 이상의 합류점으로 성장한 다음 24시간 동안 HA35 또는 PBS로 처리했습니다. 그런 다음 단분자층을 P200 피펫 팁으로 긁었습니다. 여기에 표시된 것은 비인간 영장류 장내 단층의 대조 처리에서 HA35의 대표적인 이미지입니다.
이미지는 P200 피펫 팁으로 스크래치를 수행한 후 0시간, 4시간, 12시간 및 24시간에 획득되었습니다. 상처 치유 안도이드 단층에 대한 HA35의 효과는 여기에 나와 있습니다. 장내 단층에서 시간 경과에 따른 상처 치유의 변화는 HA35 치료 농도에 따라 달라집니다.
HA35는 대조군과 비교할 때 밀리리터당 100마이크로그램 및 밀리리터당 200마이크로그램에서 4시간 12시간 후 상처 치유를 유의하게 증가시켰지만 치유율은 치료 간에 24시간까지 수렴했습니다. 이 절차에서 기억해야 할 가장 중요한 것 중 하나는 장내 장내 단층이 수명이 짧다는 것입니다. 따라서 90%가 유동적이면 조사관은 신속하게 사용해야 합니다.
이 기술은 특히 염증성 손상보다는 기계적 손상에 관심이있는 경우 체외에서 조기 장 재생을위한 모델이되었습니다.
