Este protocolo amplía el ensayo muy común de herida por rasguño utilizado para estudios de regeneración con monocapas derivadas de enteroides que representan todos los tipos principales de células del intestino delgado. Esta técnica permite la visualización en tiempo real del cierre de la herida en un modelo monocapa enteroide 2D prematuro de regeneración intestinal. Nuestra técnica se puede aplicar al estudio del intestino prematuro de mamíferos, que generalmente está mal modelado utilizando líneas celulares de cáncer colorrectal transformadas.
Comience descongelando 96 microlitros de matriz extracelular, o BME de hidrogel basado en ECM, durante la noche en hielo a dos a ocho grados centígrados. Diluir el hidrogel a base de ECM y el PBS helado sin calcio ni magnesio en una proporción de uno a 50. Cubra cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos con 200 microlitros de hidrogel diluido a base de ECM helado e incube la placa recubierta durante un mínimo de una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Luego aspire los medios de la placa de cultivo de 24 pocillos que contiene los enteroides 3D destinados a monocapas y reemplácelos con 500 microlitros de reactivo de disociación celular por pocillo. Interrumpa manualmente las cúpulas de hidrogel basadas en ECM pipeteando hacia arriba y hacia abajo de ocho a 12 veces y transfiriendo el contenido de 12 pocillos a un tubo cónico de 15 mililitros. Lave los 12 pocillos vacíos con 250 microlitros de reactivo de disociación celular para asegurarse de que se hayan eliminado todos los enteroides y transfiera el contenido a tubos cónicos de 15 mililitros.
Centrifugar los tubos cónicos a 300 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Agregue 10 mililitros de tampón de lavado DMEM / F-12 helado a los tubos cónicos y suspenda los gránulos enteroides invirtiendo los tubos. Centrifugar a 300 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y retirar el sobrenadante.
Resuspenda los gránulos celulares en 12 mililitros de tripsina-EDTA a 37 grados centígrados y coloque los tubos en un baño de agua de 37 grados centígrados durante 10 minutos o hasta que las células parezcan solubles. Agregue tres mililitros de tampón de lavado DMEM / F-12 a cada tubo para diluir la tripsina-EDTA. Mezclar invirtiendo los tubos y colocar sobre hielo.
Filtre los enteroides disociados a través de un filtro de células de malla de 37 micrómetros. Recoja el contenido en tubos cónicos limpios de 15 mililitros y centrifugue los tubos a 300 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante de los tubos cónicos y vuelva a suspender los gránulos celulares con seis mililitros de HOMGY.
A continuación, retire la placa recubierta de hidrogel a base de ECM de la incubadora y aspire cualquier exceso de solución de hidrogel a base de ECM sin rayar la superficie recubierta ni secar completamente la placa. Agregue 500 microlitros de la suspensión combinada de células HOMGY de 12 mililitros en cada pocillo de la placa de 24 pocillos recubierta con hidrogel a base de ECM. Agite la placa con la tapa puesta para asegurar una distribución uniforme de las células dentro de los pocillos.
Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, intercambiando medios HOMGY cada dos días hasta que las monocapas alcancen más del 90% de confluencia. Una vez que las monocapas alcancen más del 90% de confluencia, aspire el medio para eliminar cualquier célula que no se adhiera. Tratar las células con 500 microlitros de HA35 o PBS disueltos en HOMGY durante 24 horas.
Después de eso, retire el medio sin interrumpir la superficie de la monocapa. Usando una punta de pipeta de 200 microlitros, haga un rasguño lineal en todo el diámetro de la superficie de la monocapa en cada pocillo, teniendo cuidado de no dejar que las monocapas se sequen. Lave las monocapas rayadas una vez con 500 microlitros de 1X PBS y agregue 500 microlitros de HA35 o PBS disueltos en HOMGY.
Transfiera la placa al instrumento de análisis de células vivas dentro de una incubadora de 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. En el icono Schedule (Programado) en el software de análisis de células activas, haga clic en el icono Launch Add New Vessel Wizard (Iniciar agregar nuevo recipiente). Seleccione Escanear según lo programado, luego haga clic en Siguiente.
Seleccione Nuevo en Crear recipiente y haga clic en Siguiente, luego seleccione Todo bien en Tipo de escaneo y haga clic en Siguiente. Elija Fase para los canales de imagen y 4x para el objetivo. Seleccione el fabricante de la placa y el número de catálogo de la lista proporcionada y haga clic en Siguiente.
Seleccione una ubicación de recipiente vacía seguida del patrón de escaneo deseado. Introduzca el nombre de la placa en Nombre y, a continuación, seleccione más para crear un diseño de placa. Seleccione pequeño signo más para crear un nombre de tratamiento.
Escriba el nombre corto y, a continuación, OK. Resalte los pocillos de placa correspondientes a ese tratamiento y golpee grande más para designar pozos con ese tratamiento. Introduzca la concentración compuesta y haga clic en Aceptar. Cuando la placa esté completa, seleccione Aceptar, Siguiente. Seleccione Aplazar el análisis hasta más tarde, seguido de Crear nueva programación con escaneos a intervalos de cuatro horas.
Deje de escanear en un día, cero horas. Asegúrese de que el resumen sea correcto y, a continuación, agréguelo a la programación. En el software de análisis de células vivas, seleccione Ver en la parte superior de la pantalla.
En el menú Nombre del buque, desplácese hasta el análisis de 24 horas completado y haga doble clic en el nombre del buque. Seleccione el icono Exportar imágenes y películas a la izquierda seguido de la opción Como se muestra. Resalte los pozos de interés y, a continuación, seleccione los puntos de tiempo de interés y la serie de imágenes tal como se muestran.
Asegúrese de que el tipo de secuencia y los escaneos sean correctos. Seleccione la ubicación de la carpeta de destino deseada. Elija JPEG en el menú desplegable y luego Exportar.
Abra el software ImageJ y cargue la imagen del ensayo de la herida por arañazo. Seleccione Imagen y, a continuación, escriba 8 bits para cambiar la imagen de RGB de 24 bits. Seleccione Plugins, Macros, Install, Wound_healing_size plugin para instalar el plugin Wound Healing Size.
Después de eso, establezca el radio de la ventana de varianza en 20, el valor del umbral en 100, el porcentaje de píxeles saturados en 0.001. Sí para Establecer escala global y luego haga clic en Aceptar. Verifique que el área delineada sea el área de la herida y repita para rasguños adicionales. Finalmente, calcule el porcentaje de curación de heridas en el área de rasguño de las células migratorias o proliferantes durante 24 horas utilizando la ecuación que se muestra en la pantalla.
Aquí, T0 es el área en horas cero y TC es el área en cero horas, cuatro horas, 12 horas o 24 horas. La generación de enteroides y el procedimiento de ensayo de cicatrización de heridas monocapa derivado de enteroides se muestran en estas imágenes. Se utiliza un cultivo de enteroides intestinales de primates tridimensionales no humanos para disociarse en monocapas bidimensionales.
Las monocapas se cultivaron a más del 90% de confluencia en una placa de 24 pocillos y luego se trataron con HA35 o PBS durante 24 horas. Las monocapas se rayaron con una punta de pipeta P200. Aquí se muestran las imágenes representativas de HA35 en tratamientos de control de monocapas enteroides de primates no humanos.
Las imágenes se obtuvieron a las cero horas, cuatro horas, 12 horas y 24 horas después de realizar un rasguño con una punta de pipeta P200. El efecto de HA35 en las monocapas andoides de cicatrización de heridas se muestra aquí. El cambio en la cicatrización de heridas a lo largo del tiempo en monocapas enteroides depende de la concentración del tratamiento con HA35.
HA35 aumentó significativamente la cicatrización de heridas después de cuatro horas y 12 horas a 100 microgramos por mililitro y 200 microgramos por mililitro en comparación con el control, pero las tasas de curación convergieron entre los tratamientos en 24 horas. Una de las cosas más importantes para recordar con este procedimiento es que las monocapas enteroides intestinales son de corta duración. Por lo tanto, una vez que son 90% confluidos, los investigadores deben buscar usarlos rápidamente.
Esta técnica se ha convertido en nuestro modelo de referencia para la regeneración intestinal prematura in vitro, especialmente si estamos interesados en una lesión más mecánica que inflamatoria.
