このプロトコルは、小腸のすべての主要な細胞型を表すエンテロイド由来単層を用いた再生研究に使用される非常に一般的な引っかき傷アッセイを拡張します。この技術により、腸管再生の早産2D腸管単層モデルにおける創傷閉鎖のリアルタイム視覚化が可能になります。私たちの技術は、形質転換された結腸直腸癌細胞株を使用したモデリングが不十分な早産哺乳類の腸の研究に適用できます。
まず、96マイクロリットルの細胞外マトリックスまたはECMベースのヒドロゲルBMEを、摂氏2〜8度の氷上で一晩解凍します。ECMベースのヒドロゲルとカルシウムまたはマグネシウムを含まない氷冷PBSを1対50の比率で希釈します。24ウェル組織培養プレートの各ウェルに200マイクロリットルの氷冷希釈ECMベースのヒドロゲルをコーティングし、コーティングプレートを摂氏37度および5%の二酸化炭素で最低1時間インキュベートします。
次に、単層用の3Dエンテロイドを含む24ウェル培養プレートから培地を吸引し、ウェルあたり500マイクロリットルの細胞解離試薬と交換します。ECMベースのヒドロゲルドームを手動で破壊するには、8〜12回ピペッティングし、12ウェルの内容物を15ミリリットルのコニカルチューブに移します。12個の空のウェルを250マイクロリットルの細胞解離試薬で洗浄し、すべてのエンテロイドが除去されたことを確認し、内容物を15ミリリットルの円錐形チューブに移します。
コニカルチューブを300gで摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。10ミリリットルの氷冷DMEM/F-12洗浄バッファーを円錐形チューブに加え、チューブを反転させて腸内ペレットを懸濁します。300gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を除去する。
細胞ペレットを12ミリリットルの摂氏37度のトリプシン-EDTAに再懸濁し、チューブを摂氏37度の水浴に10分間、または細胞が可溶になるまで置きます。3ミリリットルのDMEM/F-12洗浄バッファーを各チューブに加え、トリプシン-EDTAを希釈します。チューブを反転させて混合し、氷の上に置きます。
解離したエンテロイドを37マイクロメートルのメッシュセルストレーナーでろ過します。内容物をきれいな15ミリリットルの円錐形のチューブに集め、300gで摂氏4度で5分間遠心分離します。コニカルチューブから上清を取り除き、細胞ペレットを6ミリリットルのHOMGYで再懸濁します。
次に、ECMベースのヒドロゲルコーティングプレートをインキュベーターから取り出し、コーティングされた表面を傷つけたり、プレートを完全に乾燥させたりすることなく、余分なECMベースのヒドロゲル溶液を吸引します。合わせた12ミリリットルのHOMGY細胞懸濁液を、ECMベースのヒドロゲルでコーティングした24ウェルプレートの各ウェルに500マイクロリットル加えます。蓋をした状態でプレートを回転させて、ウェル内の細胞が均一に分布するようにします。
プレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートし、単層が90%コンフルエンシーを超えるまで2日ごとにHOMGY培地を交換します。単層が90%コンフルエンシーを超えたら、培地を吸引して、付着していない細胞を取り除きます。HOMGYに溶解した500マイクロリットルのHA35またはPBSで細胞を24時間処理します。
その後、単層の表面を乱さずにメディアを取り外します。200マイクロリットルのピペットチップを使用して、単層が乾かないように注意しながら、各ウェルの単層の全面直径全体に直線的な傷を付けます。傷のある単分子膜を500マイクロリットルの1X PBSで1回洗浄し、HOMGYに溶解した500マイクロリットルのHA35またはPBSを加えます。
プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーター内の生細胞分析装置に移します。ライブセル解析ソフトウェアのスケジュールアイコンの下で、新しい船舶の追加ウィザードの起動アイコンをクリックします。[スケジュールに従ってスキャン]を選択し、[次へ]をクリックします。
[容器の作成]で[新規]を選択し、[次へ]をクリックしてから、[スキャンタイプ]で[ウェル全体]を選択して、[次へ]をクリックします。画像チャンネルにはフェーズを選択し、対物レンズには4xを選択します。表示されたリストからプレートの製造元とカタログ番号を選択し、[次へ]をクリックします。
空の容器位置を選択し、その後に目的のスキャンパターンを選択します。[名前] にプレート名を入力し、プラス を選択してプレート レイアウトを作成します。小さいプラス記号を選択して、処理名を作成します。
短い名前を入力し、[OK] を入力します。その処理に対応するプレートウェルを強調表示し、大きなプラスを押して、その処理のあるウェルを指定します。化合物濃度を入力し、[OK]をクリックします。プレートが完了したら、[OK]、[次へ] の順に選択します。[分析を後で延期する] を選択し、[4 時間間隔でスキャンして新しいスケジュールを作成する] を選択します。
1 日、0 時間でスキャンを停止します。概要が正しいことを確認し、スケジュールに追加します。ライブセル解析ソフトウェアで、画面上部の[表示]を選択します。
[船舶名]メニューから、完了した24時間のスキャンに移動し、船舶名をダブルクリックします。左側の[画像とムービーのエクスポート]アイコンを選択してから、[表示時]オプションを選択します。関心のあるウェルをハイライト表示し、[対象タイム ポイント] と [表示される一連のイメージ] を選択します。
シーケンスタイプとスキャンが正しいことを確認します。目的のターゲットフォルダの場所を選択します。ドロップダウンメニューから[JPEG]を選択し、[エクスポート]を選択します。
ImageJソフトウェアを開き、引っかき傷アッセイ画像をアップロードします。「イメージ」を選択し、「8-bit」と入力して、イメージを 24 ビット RGB から変更します。プラグイン、マクロ、インストール、Wound_healing_sizeプラグインを選択して、創傷治癒サイズプラグインをインストールします。
その後、分散ウィンドウの半径を20、しきい値を100、飽和ピクセルの割合を0.001に設定します。[スケールをグローバルに設定] で [はい] を選択し、[OK] をクリックします。輪郭が線で囲まれた領域であることを確認し、追加の引っかき傷についても繰り返します。最後に、画面上に示される式を用いて、24時間にわたる遊走または増殖細胞の創傷治癒の引っ掻き領域の割合を計算する。
ここで、T0は時刻0時の面積であり、TCは0時間、4時間、12時間、または24時間の面積である。腸内生成およびエンテロイド由来単層創傷治癒アッセイ手順がこれらの画像に示されている。三次元の非ヒト霊長類腸管エンテロイドの培養物は、2次元単層に解離するために使用されます。
単層を24ウェルプレートで90%を超えるコンフルエントまで成長させた後、HA35またはPBSで24時間処理しました。次に、単層をP200ピペットチップで引っ掻きました。ここに示されているのは、非ヒト霊長類腸質単層の対照治療におけるHA35の代表的な画像です。
画像は、P200ピペットチップでスクラッチを行ってから0時間、4時間、12時間、および24時間後に取得されました。創傷治癒および様体単層に対するHA35の効果をここに示す。腸質単層における経時的な創傷治癒の変化は、HA35治療濃度に依存する。
HA35は、対照と比較して、1ミリリットルあたり100マイクログラムおよび1ミリリットルあたり200マイクログラムで、4時間および12時間後の創傷治癒を有意に増加させたが、治癒率は24時間までに治療間で収束した。この手順で覚えておくべき最も重要なことの1つは、腸腸単層は短命であるということです。したがって、それらが90%コンフルイドになったら、調査員はそれらを迅速に使用することを検討する必要があります。
この技術は、特に炎症性損傷ではなく機械的損傷に関心がある場合、in vitroでの早産腸再生の頼りになるモデルになっています。
