Este protocolo estende o ensaio de ferida de arranhão muito comum usado para estudos de regeneração com monocamadas derivadas de enteróides representando todos os principais tipos de células do intestino delgado. Esta técnica permite a visualização em tempo real do fechamento da ferida em um modelo de monocamada enteróide 2D pré-termo de regeneração intestinal. Nossa técnica pode ser aplicada ao estudo do intestino de mamíferos prematuros, que normalmente é mal modelado usando linhas celulares de câncer colorretal transformadas.
Comece descongelando 96 microlitros de matriz extracelular, ou hidrogel BME à base de ECM, durante a noite no gelo a dois a oito graus Celsius. Diluir o hidrogel à base de ECM e o PBS gelado sem cálcio ou magnésio numa proporção de um para 50. Revestir cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 24 poços com 200 microlitros de hidrogel à base de ECM diluído a frio e incubar a placa revestida por um mínimo de uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Em seguida, aspirar o meio da placa de cultura de 24 poços contendo os enteróides 3D destinados a monocamadas e substituí-lo por 500 microlitros de reagente de dissociação celular por poço. Interrompa manualmente as cúpulas de hidrogel à base de ECM pipetando para cima e para baixo de oito a 12 vezes e transferindo o conteúdo de 12 poços para um tubo cônico de 15 mililitros. Lave os 12 poços vazios com 250 microlitros de reagente de dissociação celular para garantir que todos os enteróides tenham sido removidos e transfira o conteúdo para tubos cônicos de 15 mililitros.
Centrifugar os tubos cônicos a 300g por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o sobrenadante. Adicione 10 mililitros de tampão de lavagem DMEM/F-12 gelado aos tubos cônicos e suspenda os pellets enteróides invertendo os tubos. Centrifugar a 300g durante cinco minutos a quatro graus Celsius e remover o sobrenadante.
Ressuscite os pellets de células em 12 mililitros de 37 graus Celsius Tripsina-EDTA e coloque os tubos em banho-maria de 37 graus Celsius por 10 minutos ou até que as células pareçam solúveis. Adicione três mililitros de tampão de lavagem DMEM/F-12 a cada tubo para diluir a tripsina-EDTA. Misture invertendo os tubos e coloque no gelo.
Filtre os enteróides dissociados através de um filtro de células de malha de 37 micrômetros. Recolha o conteúdo em tubos cónicos limpos de 15 mililitros e centrifugar os tubos a 300g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante dos tubos cônicos e ressuspenda os pellets celulares com seis mililitros de HOMGY.
Em seguida, remova a placa revestida de hidrogel à base de ECM da incubadora e aspirar qualquer solução de hidrogel à base de ECM em excesso sem arranhar a superfície revestida ou secar completamente a placa. Adicione 500 microlitros da suspensão combinada de células HOMGY de 12 mililitros em cada poço da placa de 24 poços revestida com hidrogel à base de ECM. Gire a placa com a tampa para garantir uma distribuição uniforme das células dentro dos poços.
Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, trocando o meio HOMGY a cada dois dias até que as monocamadas atinjam uma confluência superior a 90%. Uma vez que as monocamadas atinjam mais de 90% de confluência, aspirar o meio para remover quaisquer células que não se liguem. Trate as células com 500 microlitros de HA35 ou PBS dissolvidos em HOMGY por 24 horas.
Depois disso, remova a mídia sem interromper a superfície da monocamada. Usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros, faça um arranhão linear em todo o diâmetro da superfície da monocamada em cada poço, tomando cuidado para não deixar as monocamadas secarem. Lave as monocamadas riscadas uma vez com 500 microlitros de 1X PBS e adicione 500 microlitros de HA35 ou PBS dissolvidos em HOMGY.
Transfira a placa para o instrumento de análise de células vivas dentro de uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No ícone Agendar no software de análise de células ativas, clique no ícone Iniciar Assistente para Adicionar Nova Embarcação. Selecione Fazer varredura no cronograma e clique em Avançar.
Selecione Novo em Criar vaso e clique em Avançar, selecione Poço inteiro em Tipo de varredura e clique em Avançar. Escolha Fase para canais de imagem e 4x para o objetivo. Selecione o fabricante da placa e o número de catálogo na lista fornecida e clique em Avançar.
Selecione um local de recipiente vazio seguido pelo padrão de varredura desejado. Insira o nome da placa em Nome e selecione mais para criar um layout de placa. Selecione pequeno mais para criar um nome de tratamento.
Digite o nome abreviado e, em seguida, OK. Destaque os poços de placa correspondentes a esse tratamento e acerte grande vantagem para designar poços com esse tratamento. Insira a concentração composta e clique em OK. Quando a placa estiver concluída, selecione OK, Avançar. Selecione Adiar análise para mais tarde, seguido de Criar nova agenda com varreduras em intervalos de quatro horas.
Pare a varredura em um dia, zero horas. Verifique se o resumo está correto e, em seguida, adicione à programação. No software de análise de células ao vivo, selecione Exibir na parte superior da tela.
No menu Nome da embarcação, navegue até a verificação concluída de 24 horas e clique duas vezes no nome da embarcação. Selecione o ícone Exportar imagens e filmes à esquerda, seguido pela opção Como exibido. Realce os poços de interesse e, em seguida, selecione os pontos de interesse de tempo e a Série de Imagens como Exibidos.
Verifique se o tipo de sequência e as varreduras estão corretos. Selecione o local da pasta de destino desejada. Escolha JPEG no menu suspenso e, em seguida, Exportar.
Abra o software ImageJ e carregue a imagem do ensaio de arranhões. Selecione Imagem e digite 8 bits para alterar a imagem de RGB de 24 bits. Selecione Plugins, Macros, Install, Wound_healing_size plugin para instalar o Wound Healing Size Plugin.
Depois disso, defina o raio da janela de variância como 20, o valor limite como 100, a porcentagem de pixels saturados como 0,001. Sim para Definir escala global e, em seguida, clique em OK. Verifique se a área delineada é a área da ferida e repita para riscos adicionais. Finalmente, calcule a porcentagem da cicatrização de feridas na área de arranhões de células migratórias ou proliferantes ao longo de 24 horas usando a equação mostrada na tela.
Aqui, T0 é a área no tempo zero horas, e TC é a área em zero horas, quatro horas, 12 horas ou 24 horas. A geração enteróide e o procedimento de ensaio de cicatrização de feridas monocamada derivado de enteroides são mostrados nestas imagens. Uma cultura de enteroides intestinais tridimensionais de primatas não humanos é usada para dissociar em monocamadas bidimensionais.
As monocamadas foram cultivadas a uma confluência superior a 90% em uma placa de 24 poços e, em seguida, tratadas com HA35 ou PBS por 24 horas. As monocamadas foram então riscadas com uma ponta de pipeta P200. Aqui são mostradas as imagens representativas do HA35 em tratamentos de controle de monocamadas enteroides de primatas não humanos.
As imagens foram obtidas às zero horas, quatro horas, 12 horas e 24 horas após a realização de um arranhão com ponta de pipeta P200. O efeito do HA35 nas monocamadas andoides de cicatrização de feridas é mostrado aqui. A mudança na cicatrização de feridas ao longo do tempo em monocamadas enteróides depende da concentração de tratamento com HA35.
O HA35 aumentou significativamente a cicatrização de feridas após quatro horas e 12 horas a 100 microgramas por mililitro e 200 microgramas por mililitro quando comparado ao controle, mas as taxas de cicatrização convergiram entre os tratamentos em 24 horas. Uma das coisas mais importantes a lembrar com este procedimento é que as monocamadas enteróides intestinais são de curta duração. Então, uma vez que eles são 90% confluidos, os investigadores devem procurar usá-los rapidamente.
Esta técnica tornou-se o nosso modelo para a regeneração intestinal prematura in vitro, especialmente se estivermos interessados em mais lesões mecânicas do que inflamatórias.
