离体 小鼠尿路上皮细胞腺病毒-Cre介导的基因缺失的类器官模型

我们开发了一种快速有效的方案，通过对正常小鼠尿路上皮细胞进行离体基因编辑来生成膀胱癌类器官，这些细胞携带感兴趣的基因中的浮出等位基因。这种离体方法具有一到两周的工作流程，而不是多年的小鼠育种，并且在Cre介导的基因缺失上的腺病毒转导中非常有效。首先，准备所有无菌仪器和试剂，包括剪刀，镊子，35毫升培养皿中的DPBS，70%乙醇，纱布和干净的纸巾。

接下来，清洁解剖区域的所有表面，并用干净的纸巾覆盖解剖区域。将安乐死小鼠放在解剖区的纱布上，在小鼠腹部喷洒70%乙醇，然后使用无菌解剖剪刀，做一个下中线腹部切口，露出膀胱。现在，使用镊子抓住并轻轻拉起膀胱以识别双侧输尿管卵巢连接处。

使用剪刀，沿着两个输尿管开口之间的边界线取出膀胱底，并将膀胱转移到含有2毫升DPBS的无菌培养皿中，然后去除脂肪和结缔组织，并将膀胱放入含有2毫升DPBS的新培养皿中。还要从零下80摄氏度的储存中取出腺病毒，并将其保存在冰上。对于细胞解离，按照手稿中所述准备所有无菌仪器和试剂，然后在生物安全柜中，将膀胱转移到35毫米培养皿中，并用2毫升无菌DPBS洗涤。

将四只小鼠的膀胱组织收集到具有一毫升完整培养基的培养皿中，没有木炭剥离的FBS。接下来，使用手术刀片，将每个膀胱切成四个相等的碎片，然后使用镊子展开膀胱，将尿路上皮表面暴露在介质中。将气囊碎片和培养基转移到15毫升离心管中。

用2毫升完整的培养基洗涤培养皿两次，没有木炭剥离的FBS，并将洗涤物加入离心管中，使总体积达到5毫升。接下来，加入胶原酶和透明质酸酶混合物，并将管水平置于37摄氏度的轨道振荡器培养箱中，以200 RPM的速度放置30分钟。组织消化后，将等体积的10%木炭剥离的FBS和DPBS加入管中，并以200倍g离心5分钟。

弃去上清液后，向细胞沉淀中加入2毫升胰蛋白酶替代品并充分混合，然后将管在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育4分钟。孵育后，用标准P1000吸头上下移液细胞10次，并加入5毫升10%木炭剥离的FBS和DPBS。通过100微米无菌细胞过滤器过滤解离的细胞，并将细胞悬浮液收集在50毫升管中。

将细胞悬浮液转移到15毫升管中，并以200倍g离心5分钟。除去上清液后，将沉淀重悬于1毫升完整的培养基中。使用血细胞计数器计数细胞数，并将0.5次板10至第6个细胞放入24孔板的每个孔中，并加入0.5毫升新鲜完整的培养基。

接下来，从零下20摄氏度的储存中取出Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞的基质提取物，并在冰上解冻。此外，在37摄氏度的细胞培养箱中预热6孔板。对于腺病毒转导，将2微升腺病毒加入24孔板中，并与解离的尿路上皮细胞充分混合。

为了提高转导功效，通过将板以300倍g离心30分钟进行旋切，然后将板在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育1小时。将细胞和培养基从孔中转移到15毫升管中，并以200倍g离心5分钟。弃去上清液后，加入50微升完全培养基，并与底部的细胞充分混合。

接下来，加入140微升基质提取物并轻轻混合以避免气泡，然后通过将每个圆顶的50微升溶液快速加入预热的6孔板中来创建类器官圆顶。孵育板，让圆顶凝固5分钟。5分钟后，将6孔板倒置，继续凝固25分钟。

孵育后，向每个孔中加入2.5毫升完整的培养基，并将板置于培养箱中进行类器官培养。在近100%的细胞中检测到绿色荧光蛋白，表明腺病毒转导效率高。苏木精和曙红染色及三重敲除类器官肿瘤的免疫组化反应显示，高级别尿路上皮癌形态，基底亚型标志物CK5和p63蛋白表达阳性。

在未用腺病毒处理的尿路上皮细胞中检测到未重组的絮状等位基因，而在三重敲除类器官中观察到重组的等位基因。一般来说，需要2至3周才能形成2厘米的皮下肿瘤。体内异种移植物的三重敲除类器官的免疫组化结果显示CK7、CK5和p63蛋白的阳性表达。

CK8和尿素蛋白的表达结果为阴性。间充质标志物vimentin仅在肿瘤囊或基质中检测到。小鼠膀胱解离不得超过30分钟。

较长的解离时间可能会增加基质细胞的百分比，例如内皮细胞和成纤维细胞这种方法可以与细胞分选或细胞型特异性腺病毒相结合，以产生细胞类型的特定类器官，例如管腔与基底类器官的比较。