小鼠膀胱肿瘤器官的培养、操作和正交移植

肿瘤器官作为体外癌模型被广泛用于肿瘤生物学研究。我们的协议提供了一个详细的程序，以隔离，培养和基因操纵膀胱肿瘤器官作为一个关键的工具，研究癌症生物学的各个方面。使用我们的协议，我们可以基因操纵膀胱肿瘤器官来表达或敲出我们感兴趣的基因。

此外，通过我们的正畸移植方法，我们可以创造出一种完整的肿瘤微环境肿瘤器官。演示这个程序的将是我们实验室的研究生金玉斌。首先从穆林膀胱肿瘤建立膀胱肿瘤器官。

在DMEM中加入10毫升的 HEPES，加入肿瘤片段，用消毒剃刀刀片切碎组织。为了将片段分离成细胞悬浮液，在1、2型胶原蛋白和热固性中加入9毫升DMEM，并在37摄氏度和5%的轨道摇床上孵育1.5至2小时。在轨道摇床上加入5%的二氧化碳。孵育后，将细胞悬浮液转移到50毫升管中。

在4摄氏度下以400倍g离心管5分钟，吸进上一代。将颗粒重新在5毫升的CK开水缓冲液中，在室温下孵育管子三到五分钟，以杀死任何红血球。同时，在24孔板中涂上150微升的冰冷生长因子，减少基底膜基质，将板放在孵化器中30分钟。

将20毫升DMEM加入细胞管中，然后重复离心。吸升液，将颗粒重新在0.25%的三氯苯乙烯和10微摩尔Y-27632二氢二氢胺中重新下水。在37摄氏度的水浴中孵育管子5分钟。

然后，通过添加 10 毫升 DMEM 与 10%FBS 中和尝试素。通过 100 微米细胞滤株将电池悬浮液过滤到新的 50 毫升管上，以清除未消化的碎屑。在4摄氏度下以400倍g离心管5分钟，吸进上一代。

然后用一毫升DMEM重新暂停颗粒，然后用血细胞计计算细胞。将三到四乘十十到四个肿瘤细胞转移到冰上的1.5毫升微管，并在400倍g下离心，在4摄氏度下3分钟。小心地去除上先液，在500微升的预战器官介质和10微摩尔Y-27632中重新暂停细胞。

将细胞悬浮液转移到先前准备的膜基质涂层良好，然后将 24 孔板放回培养箱中。每两天用500微升预谋的有机体介质代替该介质。在伦蒂病毒介质的转导前12小时分离肿瘤器官。

第二天，在37摄氏度的水浴中迅速解冻含有等分的病毒。将解冻的病毒加入250微升的有机介质中，每毫升六甲基溴为10微摩尔Y-27632和8微克。用含有介质的500微升病毒取代24井板中的有机介质，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育该细胞，12至16小时。

为了准备膀胱肿瘤器官进行正畸移植，在24井板的器官介质中加入500微升的胶原酶去发。移液地下室膜基质和介质上下，然后在37摄氏度下孵育板20分钟。孵育后，将细胞收集到15毫升的管子中，并加入5毫升的预战DMEM。

然后在400倍g下离心管，在4摄氏度下3分钟，吸上一代。用一毫升DMEM重新暂停颗粒，将溶液转移到90毫米培养皿中。在显微镜下，用P200移液器拾取10到100个肿瘤器官，然后收集到冰上的微管中。

离心微管，小心地取出上一代。然后在冰上保持颗粒，直到小鼠准备好手术。在亚粘膜膀胱壁移植之前，将注射器、移液器尖端和地下室膜基质放在冰上，直到准备好使用。

小鼠麻醉后，将鼠标放在一个上角位置，通过面膜吸入2%蒸发的异氟素来维持麻醉。用无菌纱布涂抹波维酮碘，然后用70%乙醇将其擦拭。用无菌手术剪刀在中下腹部的皮肤和肌肉壁上做一个小的横向切口。

从腹腔暴露膀胱，用盐水浸泡棉签支撑膀胱。将含有50%高浓度基底膜基质的80微升器官颗粒重新悬浮，使用胰岛素注射器将悬浮液注入膀胱圆顶前部。用4-0尼龙缝合线关闭切口，用聚酮碘和70%乙醇对手术部位进行消毒。

让鼠标在红外照射器下恢复 10 至 15 分钟。然后再次监测鼠标，直到它恢复知觉。小鼠膀胱肿瘤器官建立和培养九天。

如果肿瘤细胞不形成肿瘤器官，它们有可能在分离步骤中死亡，酶消化时间可能需要调整。膀胱肿瘤器官表现出强烈的GP信号与成功的扁病毒感染。浓度后，总共250微升含有介质的病毒足以感染地下室膜基质上的3万个单一肿瘤细胞，并保持90%至100%的感染效率。

膀胱肿瘤全谱在正畸移植三周后采集，并使用H&E染色分析肿瘤组织学。肿瘤器官的正畸移植可以作为膀胱肿瘤生长两到三周。按照这个程序，研究人员可以对由此产生的肿瘤器官进行免疫组织化学，或对感兴趣的基因进行定量RT-PCR。

这些实验可以进一步描述肿瘤器官。我们的协议允许我们轻松操作癌细胞中的基因，与小鼠模型相比，同时保持肿瘤的体内特征，以研究膀胱癌肿瘤发生所涉及的各种基因的具体功能。