膀胱癌类器官作为精准医疗工具的文化

这种方法意义重大，因为患者来源的类器官为研究泌尿系统癌症提供了一种快速而强大的工具，因为它们经常模仿这种多谱疾病的遗传和表型异质性。类器官可以从有限量的患者活检材料中分离出来，并且可以快速扩增用于下游分析。使用该协议生成的类器官既可以用作模型，以帮助我们了解泌尿系统癌症的细胞和分子基础，也可以用作精准医学工具，让我们预测癌症可能对哪些治疗和个体患者有反应。

首先，从手术中收集新鲜的宏观上可行的肿瘤标本，并确保在运输过程中将样品浸没在无菌的50毫升锥形管或尿液标本罐中的运输介质中。在患者标本处理表上记录标本详细信息，包括组织重量、样本描述以及有关任何血液和尿液样本的详细信息。小心地用10毫升基底培养基替换运输培养基，让肿瘤组织通过重力沉降。

接下来，使用镊子，取出肿瘤组织并将其置于无菌的90毫米培养皿中。在临床标本处理片和解剖网格上以克或毫克为单位记录组织的重量。然后使用无菌镊子在安装在手术刀手柄上的一次性手术刀刀片中，去除非癌组织和宏观可见的坏死区域。

用冷的DPBS清洗肿瘤碎片一次或两次，然后收集并将它们转移到新的无菌90毫米培养皿中。拍摄照片，绘制组织图，并在临床处理网格上计划组织解剖。对于组织病理学分析，将大约50毫克的肿瘤组织放入标记的一次性塑料组织学盒中。

然后将组织学盒浸入具有5X至10X体积的10%中性缓冲福尔马林的容器中并孵育过夜。第二天，用70%乙醇代替福尔马林，在四摄氏度下储存，直到组织可以处理。对于分子分析，在RNase中快速冷冻至少一个肿瘤片段，使用液氮游离DNase 1.5毫升冷冻卵巢并储存在零下80摄氏度。

接下来，在含有剩余肿瘤碎片的90毫米培养皿中分配五毫升类器官培养基，并机械地将组织尽可能细地切碎。使用无菌10号手术刀刀片。将切碎的组织转移到50毫升锥形管中，并加入4毫升类器官培养基，1毫升10X胶原酶/透明质酸酶和0.1毫克/毫升DNase I以避免细胞结块。

将切碎的肿瘤组织在酶溶液中孵育一到两个小时，在培养箱中的轨道振荡器或旋转器上，将片段解离成细胞悬浮液并分解胶原蛋白。然后通过向样品中加入两倍体积的基础培养基来停止消化。离心样品，吸出，弃去上清液。

接下来，为了裂解污染的红细胞，将沉淀重悬于五毫升氯化铵钾缓冲液中，并将管在室温下孵育三分钟或直到看到红细胞的完全裂解。然后将20毫升基础培养基加入管中。再次离心并吸出上清液。

在此步骤中，将10毫升等分试样的2X和1X类器官培养基置于37摄氏度的水浴中加热。首先将样品通过预湿的可逆100微米过滤器过滤到新的50毫升管中，以除去大的不溶性物质。然后通过预湿的可逆37微米过滤器过滤洗脱液，以将单个细胞收集成小簇，用于单细胞和免疫细胞分离。

接下来，反转37微米过滤器并加入10毫升基础培养基以收集小而中等大小的簇。用DPBS将这些新的50毫升管中的每一个加满到40毫升，然后离心悬浮液并丢弃上清液。接下来，将10毫升基础培养基加入含有单细胞的管中，并在自动细胞计数器中使用台盼蓝排除染料对细胞进行计数。

确定细胞的细胞数量和活力。离心剩余的样品，用含有10%胎牛血清1%青霉素和链霉素以及10%DMSO的细胞冷冻溶液或基础培养基替换培养基，然后将样品置于1.5毫升冷冻管中，将其储存在自冷冻容器中，并立即将容器转移到零下80摄氏度的冰箱中。第二天，将冷冻管转移到低温液相或气相储存中以长期储存。

接下来，用500微升预热的2X类器官培养基重悬收集的小型和中等大小的簇。然后用冰冷的P-1000无菌过滤移液器吸头，将BME加入细胞中并轻轻混合。快速小心地将100微升的重组细胞BME混合物移液到超低附着的平底96孔板的孔中，并将板置于培养箱中20至30分钟以固化。

孵育后，根据经验评估的体积，以一到两的比例在BME细胞悬浮液上加入类器官培养基，并将板置于培养箱中20分钟以平衡。孵育后，从培养箱中取出板并将其组装在显微镜载物台上的标本架上，以在相差或明场设置下直观地评估类器官。每两到三天使用50微升预热的类器官培养基补充培养基，以补充耗尽的生长因子和总体积。

在传递之前获取第 1、2 和 3 天以及第 5、7 和 10 天的延时系列图像。用市售胶原酶/透明质酸酶和DNase I对膀胱癌组织进行两小时消化，导致0.5至1立方毫米更复杂的膀胱切除术活检组织充分消化，包括膀胱固有层和肌肉层内的肿瘤细胞。较大的消化后片段适用于培养和任何尺寸的标准组织培养板，以分离新的二维培养物。

由该程序产生的类器官经历动态自组装，包括聚集，压实和最终形成紧密细胞结构的阶段。从组织学上讲，这些结构概括了原始患者肿瘤。该过程中产生的类器官适用于许多目的，包括进一步的组织病理学表征，生物样本库和药物疗效测试。

在一代类器官之后，可以使用其他方法来分析这些肿瘤，包括抗癌治疗的作用，代谢分析或转录分析。在这个3D框架内，这些额外的方法为膀胱癌生物学提供了强大的洞察力。该方法是研究免疫肿瘤学和细胞代谢的重要基础。