使用基质辅助激光解吸/电离质谱成像在 果蝇 脑中快速脂质分析的样品制备

Maldi MS光谱成像是一种成熟且有用的工具，无需过度的样品修饰即可识别和可视化脂质丰度和分布。Maldi成像的主要优点是能够在不标记的情况下原位检测脂质，并同时分析大量样品。熟能生巧。

在处理真正的实验样品之前，请确保您练习得很好。最大限度地减少样品制备时间，并避免在整个过程中受到污染。首先，将最佳切割温度或OCT添加到塑料冷冻机中，使其达到冷冻模具深度的一半，同时避免形成气泡。

将模具放在平坦的表面上几分钟，然后将其转移到干冰上。将冷冻机平放在干冰上，让OCT形成平坦而平坦的表面。等到OCT在模具中完全凝固。

立即使用冷冻的OCT载物台，或将其存放在零下80摄氏度。使用二氧化碳麻醉成年苍蝇后，准备含有一块实验室湿巾的培养皿。用水润湿部分湿巾，减少静电。

保持湿巾半湿半干。在解剖范围一下切割苍蝇头后，收集四到五个头并将它们放在实验室擦拭布的干燥区域。将OCT载物台从干冰到显微镜二。

立即将磁头转移到OCT阶段并快速排列，这大约需要30到60秒以避免OCT熔化。在每个苍蝇大脑周围留出大约一毫米的空白空间，以确保OCT有足够的支撑，并从块的边缘留出四到五毫米的空白空间，以提供足够的空间来处理该部分。将OCT载物台放回干冰上，让它保持约三分钟，以确保OCT载物台保持冻结和固体。

将所有飞头对齐后，让 OCT 载物台在干冰上再静置 5 到 10 分钟。将OCT载物台从干冰转移到平坦的表面上，然后快速加入大量OCT化合物以覆盖所有样品并填充整个冷冻模具，这大约需要三秒钟。立即将冷冻机转移回干冰中，并冷冻包含嵌入组织的整个OCT块。

让 OCT 载物台在干冰上再静置 5 到 10 分钟。在冷冻机的边缘标记样品，并将冷冻样品储存在零下80摄氏度，直到准备好切片。通过使用设置为电阻的电压表测试 ITO 载玻片的电导率来确认 ITO 编码侧。

用电阻测量标记一面作为粘附组织的一面。贴上标签，并始终在载玻片底部设置实验室擦拭布，以避免载玻片污染。然后，让组织在低温恒温器室中平衡 30 到 45 分钟。

清洁低温恒温器，最好用70%乙醇。在舞台上擦拭辊板并取出用过的刀片。在切片开始之前，使用额外的清洁湿巾确保乙醇已蒸发并且所有表面都干燥。

接下来，根据组织的类型调节低温恒温器室砂标头的温度。使用 OCT 将组织安装在标本支架上。注意使用足够的 OCT 来覆盖 OCT 块的底部，并将块安装得尽可能平坦。

将干净的刀片放在载物台上并锁定。根据需要将试样的头部朝向载物台，以达到所需的切割角度。然后开始厚切片切割，直到找到感兴趣的区域。

用预冷的艺术家刷不断刷掉多余的作品，以保持舞台清洁。根据需要稍微调整腔室温度，并在达到所需区域后将切片的厚度更改为 10 至 12 微米。仔细收集所需的部分。

取一张室温ITO载玻片并将其放置在切片上。轻轻接近该部分并将其粘附在载玻片上，而不会在低温恒温器载物台上留下痕迹。将载玻片放在架子上，或在低温恒温器外的实验室擦拭中，在多个部分的集合之间。

如果需要在同一队列的不同样品之间进行比较，请将多个样品的切片放在一张载玻片上，以便可以同时分析它们以最大程度地减少差异。如有必要，可分离为两个载玻片，因为 Maldi 靶支架可以在一次运行中容纳两个载玻片。将真空盒中的载玻片运送到以干燥剂为底层的干燥剂中。

在真空下驱动载玻片30至60分钟，然后进行基质沉积。使用二五二羟基苯甲酸或DHB在甲醇水中作为基质。将载玻片放入载玻片运输器中，并用蜡膜牢固地密封开口。

用拉链袋密封。将其放入另一个装有干燥剂的拉链袋中。在外部贴上标签，并将样品运送到具有足够干眼症的Maldi核心设施。

对于基质沉积，使用每毫升40毫克的DHB和甲醇水作为基质，并使用自动HTX M5基质喷雾器喷洒。使用 10 PSI 的氮气压力。使用Maldi飞行时间，MS仪器和正离子模式来获取质谱。

通过将 0.5 微升红磷乳液在 aceto Nitro 中点样到 ITO 载玻片上来校准仪器。使用它的光谱通过应用二次校准曲线在 100 至 1000 MZ 质量范围内校准仪器。将激光光斑直径设置为中等，因为它是 40 微米光栅宽度的调制光束轮廓，并通过以每个阵列位置 1000 赫兹的激光重复率对 500 次射击求和来收集成像数据。

然后记录光谱数据。使用均方根归一化执行成像数据分析，以正负0.10道尔顿的带宽生成离子图像。使用该软件对齐来自同一实验的OCT和脑组织的光谱，以评估OCT离子抑制干扰中的重叠峰。

最后，通过苏木精和伊红或H和E染色处理含有组织样品的MALDI载玻片。来自Maldi MS分析的图像显示LPR1敲除突变体脑中的脂质含量普遍降低。此处显示了具有代表性的H和E染色成年苍蝇脑切片。

图中还显示了脂质种类、它们各自的 MZ 值以及热图的刻度。与至少四个生物学重复的对照相比，LPR1敲除突变体的平均减少倍数显示在箭头旁边。对照果蝇和突变果蝇脑组织区域中选定的空白OCT区域的质谱图显示在MZ1至1000和MZ520至900的范围内。

OCT的干扰与离子抑制现象和重叠信号问题有关。为了保持脂质组学数据的保真度，适当的样品制备、解剖和冷冻切片至关重要。进行Maldi实验后，可以通过LCMS（也称为液相色谱，基于质谱的脂肪组学）验证脂质的特性。

该技术通过使用强大的软模型系统获得了有关脑脂质稳态的分子见解，该系统为理解与人类疾病相关的大脑代谢变化铺平了道路。