缺乏隧道纳米管特异性标记限制了该领域的进展，并且对识别，表征和量化隧道纳米管的方法的需求不断增加。如果没有开发算法和/或更改现有算法的专业知识，自动检测方法很难实现，但是我们的手动方法很容易以更高的精度实现。通过隧道纳米管的长距离细胞间转移在各种疾病模型中以多种方式实现，包括神经退行性病理学、病毒传播和癌症。
因此，对隧道纳米管的研究以了解其在发病机制中的作用非常重要。隧穿纳米管可能会在染色过程中断裂。避免使用盖玻片和安装在载玻片上，而是使用玻璃底部成像皿。
改良的固定方案有助于保持隧道纳米管的完整。演示该程序的将是Sangeeta NAF实验室的博士生Deepak KV。首先，在固定前用PBS洗涤对照和寡聚A-β处理的细胞两次，持续两分钟。
使用溶解在pH 7.2的0.1摩尔磷酸盐缓冲液中的2%福尔马林固定剂和2.5%戊二醛制备Karnovsky的固定剂溶液。然后通过在室温下加入Karnovsky的固定溶液45分钟来固定成像皿中的细胞。通过将0.1克皂苷溶解在5毫升FBS中并通过加入95毫升PBS稀释来制备孵育缓冲液。
然后使用孵育缓冲液洗涤固定细胞两次，持续两分钟。固定后，加入第一个抗磷酸化-PAK1的抗体，在孵育缓冲液中加入1至250的稀释液，并在黑暗潮湿的室中以4摄氏度孵育过夜。孵育24小时后的第二天，用孵育缓冲液洗涤细胞两次，持续两分钟。
然后加入与Alexa Fluor 488和鬼笔环肽555偶联的二抗。将细胞在室温下在黑暗潮湿的室中孵育1.5小时。孵育后，用孵育缓冲液洗涤细胞两次，持续两分钟。
通过在 1 到 2000 稀释液中加入 DAPI 来染色细胞核，并在室温下在黑暗中孵育 5 至 10 分钟。使用25毫克DABCO在90%甘油和10%PBS中制备DABCO封片剂。为了正确溶解，使用分光光度级稀盐酸将pH调节至8.6，并将溶液保持在摇杆上进行混合。
作为抗漂白剂，将DABCO封片剂直接添加到底部包含盖玻片的成像皿上。等待至少一到两个小时，然后直接进行共聚焦成像。为了识别隧道纳米管，使用共聚焦激光扫描显微镜捕获免疫染色细胞的Z-stack图像，方法是首先选择通道并在共聚焦软件中的窗口轨道一，轨道二和轨道三中依次单击所需的激光器。
单击轨道一个窗口下方的选项 TPMT，以拍摄带有荧光通道的微分干涉对比图像。选择软件的"采集"选项卡，单击"Z-stack"选项卡，然后等待窗口打开。然后单击实时扫描以聚焦培养皿底部的细胞。
选择该聚焦图像作为第一个堆栈，然后向上聚焦以查看单元格的最顶层，并选择该图像作为最后一个堆栈。停止实时扫描并单击"最佳"选项卡旁边的数字以固定堆栈的步长，该步长根据细胞的厚度确定切片的数量和间隔。使用 405 纳米、488 纳米和 561 纳米激光器拍摄 DAPI、FITC 和 TRITC 三个通道的连续图像，并以 1.02 微秒的像素停留时间进行捕获。
使用荧光通道捕获DIC通道中的图像以观察细胞边界。打开斐济软件中以czi数据格式保存的共聚焦图像进行分析。选择"超级堆栈"选项以查看图像的每个 Z 堆栈和通道。
滚动通道和 Z 堆栈滚动条以选择感兴趣的特定通道的确切堆栈。然后首先通过滚动通道栏选择 F-肌动蛋白染色通道，并手动滚动 Z 堆栈以逐个查看每个堆栈。识别 F 肌动蛋白染色结构，这些结构似乎是连接在 Z 堆栈下部可见的细胞，并且靠近成像皿表面，Z 等于 2 作为神经突。
识别隧道纳米管，通过将Z堆栈从Z等于4向顶部滚动Z堆栈来识别隧道纳米管，F-肌动蛋白正悬停细胞到细胞导管。寻找靠近 Z 堆栈下部朝向表面的神经突，并观察到它们开始消失，Z 堆栈在 Z 等于 6 时向顶部滚动。通过分析来自Z堆栈的导管的悬停性质，鉴定磷酸化-PAK1正隧道纳米管与F-肌动蛋白正隧道纳米管类似。
由于磷酸化-PAK1染色比F-肌动蛋白染色弱，因此在Z等于4和Z等于6处寻找磷酸化PAK1染色的隧道纳米管。此外，观察DIC图像以验证F-肌动蛋白和磷酸化PAK1染色隧道纳米管结构是细胞之间的膜导管。此外，合并F-肌动蛋白和磷酸化-PAK1通道以验证鉴定的隧道纳米管是F-肌动蛋白和磷酸化-PAK1共染色结构。
要量化隧穿纳米管，请手动计算总细胞数和识别的隧穿纳米管，并将数字表示为百分比。为了从Z堆栈图像中区分F-肌动蛋白和β III微管蛋白正隧道纳米管（如悬停导管），合并F-肌动蛋白和β III微管蛋白通道，然后分析合并图像的Z堆栈。寻找专门F-肌动蛋白染色的隧道纳米管，这些纳米管在Z等于3时隐约可见，在Z等于6和Z等于9时突出。
同样，识别 F-肌动蛋白和 β III 微管蛋白。双正隧穿纳米管，如悬停导管，Z 等于 6 和 Z 等于 9。从 Z 堆栈的下部识别其他 F-肌动蛋白和 β III 微管蛋白染色的非悬停突起。
使用斐济的线工具测量隧道纳米管的直径。通过单击"分析"验证测量比例，然后设置比例，以便自动设置与 czi 图像的距离（以像素为单位）。测量XY平面上隧穿纳米管的直径。
使用斐济的体积查看器插件，允许 3D 重新切片和启用阈值的 3D 可视化，将 Z 堆栈图像拆分为单独的通道。然后裁剪单通道Z堆栈图像以使用3D重建视图一次突出显示一个或两个隧道纳米管或神经突。在XY平面上钉一个隧道纳米管或神经突，并标记XZ和YZ通道横截面。
观察XZ平面底部，XZ和YZ平面的神经突，以及上Z堆栈中的隧穿纳米管。选择单个隧道纳米管或神经突体以在 XZ 平面中重建 3D 体积视图。在3D重建中，观察Z平面底部的神经突和隧穿纳米管显示为悬停结构，连接两个细胞而不接触底部Z平面。
分析具有F-肌动蛋白和磷酸化PAK1的免疫染色细胞的共聚焦Z堆栈图像以鉴定隧道纳米管。此外，分析DIC图像以验证F-肌动蛋白和磷酸化PAK1染色隧道纳米管结构是细胞之间的膜导管。用F-肌动蛋白和β III微管蛋白对细胞进行双重免疫染色，隧道纳米管样F-肌动蛋白和隧道纳米管样F-肌动蛋白和β III微管蛋白双阳性膜导管与仅F-肌动蛋白阳性隧道纳米管区分开来。
通过构建3D体积视图图像，将磷酸化PAK1和F-肌动蛋白共表达的隧道纳米管与其他神经突起区分开来。使用正确的固定剂很重要，因为样品的不完全固定可能导致靶蛋白的快速蛋白水解降解和特异性免疫反应性的降低。
