结合3D磁力致动器和多功能荧光成像来研究细胞核力学生物学

在这种方法中，力直接施加到原子核上。这解耦了细胞质膜和细胞骨架的力传递效应，揭示了核机械传感的分子机制。该力以非侵入性方式施加在活细胞内。

与光镊相比，磁场和磁力不会影响细胞功能，并且具有更高的吞吐量。通过称量0.2克平均直径为7微米的羰基铁微珠，开始用磁性微珠培养细胞。使用移液管将微珠悬浮在一毫升RPMI 1640培养基中。

然后将带有B2B细胞的培养皿带到生物安全柜中，并快速将200微升含有微珠的培养基加入培养皿中。将培养皿放入培养箱中，直到微珠被细胞内化。打开倒置显微镜并使用共聚焦荧光成像，通过可视化微珠、细胞核和细胞边界，每六小时确定细胞系内化的最佳时间。

内化的微珠将存在于细胞边界内。对于小力应用和活细胞成像，请打开软件应用程序元素。要定义磁性查找的配置，请单击"一加二"按钮将扫描速度设置为每两秒一帧。

将针孔尺寸设置为 1.2 通风单位。仅检查FITC通道，并将PMT HV设置为70，偏移为零，激光强度为10。要定义磁性 YAP 核的配置，请单击"四过一"按钮，将扫描速度设置为每四秒一帧。

然后单击 1.2 艾里单位按钮，将针孔尺寸设置为 1.2 艾里单位并检查 FITC 通道。将PMT HV设置为70，偏移为零，激光强度设置为10。为了成像细胞核边界和核染色强度，请检查花青5通道。

请勿单击 1.2 Airy 单位按钮并将 PMT HV 设置为 70，偏移为零，激光强度设置为 10。针孔尺寸将针对三维YES相关蛋白质成像进行优化。接下来，通过元素打开 DIA。

打开旋转视图，使用明场并调整对象的焦点，以获得清晰的细胞聚焦图像。使用10X物镜在三种条件下找到合适的多个单细胞，例如细胞内部只有一个微珠，内部有多个微珠，内部没有任何微珠。然后切换到40X物镜，并用适当的位置编号命名这个位置。

打开元素，单击磁性查找，删除互锁，然后扫描选项卡，然后选择顶部和底部按钮以调整焦平面的Z位置，以设置所选单元格的Z堆栈的下限和上限。再次单击扫描停止扫描。切换到磁性 YAP 核配置并将文件名设置为 before_small_force.nd2。

单击带有记录的 Z 堆栈的运行按钮。切换到正确的光路并打开 DIA。 打开旋转视图并单击录制按钮。

通过旋转磁铁移动设备的旋钮，将磁铁移动到培养皿底部上方 46 毫米处。保存并检查视频以确认磁力引起的微珠位移。通过将文件名设置为 after_small_force.nd2 来重复扫描过程。

接下来，切换到正确的光路，打开 DIA 并打开旋转视图，然后单击录制按钮。将磁铁移动设备旋钮旋转至培养皿底部上方120毫米处，并保存明场图像序列或视频。通过将文件名设置为 before_large_force.nd2 来重复扫描步骤。

微珠在FITC或花青5通道的激光激发下不能发出荧光。因此，内化的微珠通过位于YES相关蛋白质和细胞核荧光共聚焦成像中的暗空洞进行鉴定。核循环性显示对照细胞和微珠内化细胞之间没有显着差异。

与微珠共培养但未内化的对照细胞和具有微珠内化的细胞的YES相关蛋白细胞核与细胞质比也显示出无显着差异。肌动蛋白的细胞核变形和解聚是由含细胞骨架细胞中微珠施加的压缩力引起的。定量成像分析提供的定量AFM力位移关系提供的校准曲线。

基于这种关系，估计了珠子施加的力。在施加或释放磁力时观察到细胞核变形和YES相关的蛋白质易位。绿色通道中YES相关蛋白的强度变化和红色通道中细胞核染色的无变化证实了磁力诱导的核变形是由YES相关蛋白易位引发的。

两组内YES相关蛋白核与细胞质比的净变化的定量证实，施加在细胞质内微珠上的磁力诱导了YES相关蛋白易位并改变了YES相关蛋白核与细胞质的比值。在施加力和成像之前，请确保细胞已内化磁性微珠并且磁珠在细胞边界内。