이 방법에서는 힘이 핵에 직접 적용됩니다. 이것은 세포 원형질막과 세포 골격에서 힘 전달 효과를 분리하여 핵 기계 감지의 분자 메커니즘을 드러냅니다. 힘은 비침습적인 방식으로 살아있는 세포 내에 적용됩니다.
광학 핀셋에 비해 자기장과 자기력은 셀 기능에 영향을 미치지 않으며 처리량이 더 높습니다. 평균 직경이 7 마이크로미터인 카보닐 철 마이크로비드 0.2 그램의 칭량에 의해 자성 마이크로비드로 세포를 배양하기 시작한다. 마이크로비드를 피펫을 사용하여 1 밀리리터 RPMI 1640 배지에 현탁시킨다.
그런 다음 B2B 세포가 있는 페트리 접시를 생물안전 캐비닛으로 가져가 마이크로비드가 포함된 배지 200마이크로리터를 페트리 접시에 빠르게 추가합니다. 마이크로 비드가 세포에 의해 내재화 될 때까지 인큐베이터에 페트리 접시를 넣으십시오. 도립 현미경을 열고 컨포칼 형광 이미징을 사용하여 마이크로비드, 핵 및 세포 경계를 시각화하여 6시간마다 세포주의 내재화를 위한 최적의 시간을 결정합니다.
내재화된 마이크로비드는 세포 경계 내에 존재할 것이다. 작은 힘 응용 프로그램 및 라이브 셀 이미징의 경우 소프트웨어 응용 프로그램 Elements를 엽니다. 구성 자기 찾기를 정의하려면 1개 이상의 2개 버튼을 클릭하여 스캔 속도를 2초당 1프레임으로 설정합니다.
핀홀 크기를 1.2 Airy 단위로 설정합니다. FITC 채널만 확인하고 PMT HV를 70으로, 오프셋을 0으로, 레이저 강도를 10으로 설정합니다. 구성 자기 YAP 핵을 정의하려면 4개 이상의 버튼을 클릭하여 스캔 속도를 4초당 1프레임으로 설정합니다.
그런 다음 1.2 Airy 유닛 버튼을 클릭하여 핀홀 크기를 1.2 Airy 유닛으로 설정하고 FITC 채널을 확인합니다. PMT HV를 70으로, 오프셋을 0으로, 레이저 강도를 10으로 설정합니다. 핵 경계 및 핵 염색 강도를 이미징하려면 시아닌 5 채널을 확인하십시오.
1.2 Airy 단위 버튼을 클릭하지 말고 PMT HV를 70으로, 오프셋을 0으로, 레이저 강도를 10으로 설정하십시오. 핀홀 크기는 3차원 YES 관련 단백질 이미징에 최적화됩니다. 그런 다음 엘리먼츠를 통해 DIA를 켭니다.
스핀 뷰를 열고 명시야를 사용하고 물체의 초점을 조정하여 초점이 맞는 세포의 선명한 이미지를 얻습니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 내부에 단일 마이크로비드가 있는 세포, 내부에 여러 마이크로비드가 있는 셀, 내부에 마이크로비드가 없는 셀과 같은 세 가지 조건에서 적절한 다중 단일 셀을 찾습니다. 그런 다음 40X 대물렌즈로 전환하고 적절한 위치 번호로 이 위치의 이름을 지정합니다.
요소를 열고 자기 찾기를 클릭하고 인터록을 제거한 다음 탭을 스캔한 다음 상단 및 하단 버튼을 선택하여 선택한 셀의 Z 스택에 대한 하한과 상한을 설정하기 위해 초점면의 Z 위치를 조정합니다. 스캔을 다시 클릭하여 스캔을 중지합니다. 자기 YAP 핵 구성으로 전환하고 파일 이름을 before_small_force.nd2로 설정합니다.
기록된 Z 스택이 있는 실행 버튼을 클릭합니다. 올바른 광 경로로 전환하고 DIA를 켭니다. 스핀보기를 열고 녹음 버튼을 클릭하십시오.
자석 이동 장치의 손잡이를 돌려 페트리 접시 바닥에서 46mm 위로 자석을 이동합니다. 비디오를 저장하고 확인하여 자기력에 의해 유도된 마이크로비드 변위를 확인합니다. 파일 이름을 after_small_force.nd2로 설정하여 스캔 절차를 반복합니다.
그런 다음 오른쪽 조명 경로로 전환하고 DIA를 켜고 녹음 버튼을 클릭하기 전에 스핀보기를 엽니 다. 자석 이동 장치 손잡이를 페트리 접시 바닥에서 최대 120mm까지 돌리고 명시야 이미지 시퀀스 또는 비디오를 저장합니다. 파일 이름을 before_large_force.nd2로 설정하여 스캔 단계를 반복합니다.
마이크로비드는 FITC 또는 시아닌 5 채널에서 레이저 여기 하에서 형광을 방출할 수 없습니다. 따라서, 내재화된 마이크로비드는 YES 관련 단백질 및 핵의 형광의 공초점 이미징에 위치한 어두운 중공에 의해 확인되었다. 핵 원형도는 대조군 세포와 마이크로비드 내재화를 갖는 세포 사이에 유의한 차이를 나타내지 않았다.
마이크로비드와 공동 배양되었지만 내재화가 없는 대조군 세포와 마이크로비드 내재화가 있는 세포의 YES 관련 단백질 세포핵 대 세포질 비율도 유의한 차이가 없는 것으로 나타났습니다. 액틴의 핵 변형 및 해중합은 세포 골격 함유 세포에서 마이크로 비드에 의해 적용된 압축력에 의해 발생했습니다. 정량적 AFM 힘 변위 관계에 의해 제공되는 정량적 이미징 분석 교정 곡선.
이러한 관계에 기초하여, 적용된 비드 힘이 추정되었다. 핵 변형 및 YES-관련 단백질 전좌는 적용 또는 자기력의 방출 시 관찰되었다. 녹색 채널에서 YES 관련 단백질의 강도 변화 및 적색 채널에서 핵 염색의 변화가 없는 것은 YES 관련 단백질 전좌에 의해 유발된 자기력 유도 핵 변형임을 확인하였다.
두 그룹 내에서 YES 관련 단백질 핵 대 세포질 비율의 순 변화의 정량화는 세포질 내 마이크로 비드에 적용된 자기력이 YES- 관련 단백질 전좌를 유도하고 YES- 관련 단백질 핵 대 세포질 비율을 변화 시켰음을 확인했다. 힘과 이미징을 적용하기 전에 세포가 자성 마이크로비드를 내재화하고 비드가 세포 경계 내에 있는지 확인하십시오.
