في هذه الطريقة ، يتم تطبيق القوة مباشرة على النواة. هذا يفصل تأثير انتقال القوة عن غشاء بلازما الخلية والهيكل الخلوي ، ويكشف عن الآليات الجزيئية للاستشعار الميكانيكي النووي. يتم تطبيق القوة داخل الخلايا الحية بطريقة غير جراحية.
بالمقارنة مع الملقط البصري ، لا يؤثر المجال المغناطيسي والقوة المغناطيسية على وظائف الخلية ولهما إنتاجية أعلى. ابدأ في زراعة الخلايا بالميكروبيدات المغناطيسية بوزن 0.2 جرام من ميكروبيدات الحديد الكربونيل التي يبلغ قطرها المتوسط سبعة ميكرومتر. الميكروبيدات في وسط ثقافة RPMI 1640 ملليلتر واحد باستخدام ماصة.
ثم خذ طبق بتري مع خلايا B2B إلى خزانة السلامة الحيوية وأضف بسرعة 200 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على ميكروبيدات في طبق بتري. ضع طبق بتري في حاضنة حتى يتم استيعاب الميكروبيدات بواسطة الخلايا. افتح المجهر المقلوب وباستخدام التصوير الفلوري متحد البؤر ، حدد الوقت الأمثل لاستيعاب خطوط الخلية كل ست ساعات من خلال تصور حدود الميكروبيدات والنووية والخلوية.
ستكون الميكروبيدات الداخلية موجودة داخل حدود الخلية. لتطبيق القوة الصغيرة وتصوير الخلايا الحية ، افتح عناصر تطبيق البرنامج. لتحديد البحث المغناطيسي للتكوين ، انقر فوق الزر واحد فوق اثنين لضبط سرعة المسح على إطار واحد كل ثانيتين.
اضبط حجم الثقب على 1.2 وحدة جيدة التهوية. تحقق فقط من قناة FITC واضبط PMT HV على 70 ، وإزاحته على أنه صفر ، وشدة الليزر على 10. لتحديد تكوين نواة YAP المغناطيسية ، اضبط سرعة المسح على إطار واحد لكل أربع ثوان بالنقر فوق الزر واحد فوق أربعة.
ثم انقر فوق زر وحدة التهوية 1.2 لضبط حجم الثقب على وحدة 1.2 Airy وتحقق من قناة FITC. اضبط PMT HV على 70 ، والإزاحة على الصفر ، وشدة الليزر على أنها 10. لتصوير حدود النواة وشدة البقع النووية ، تحقق من قناة السيانين 5.
لا تنقر فوق زر وحدة التهوية 1.2 واضبط PMT HV على 70 ، والإزاحة إلى الصفر وشدة الليزر إلى 10. سيتم تحسين حجم الثقب لتصوير البروتين ثلاثي الأبعاد المرتبط ب YES. بعد ذلك ، قم بتشغيل DIA من خلال العناصر.
افتح عرض الدوران ، واستخدم حقل ساطع واضبط تركيز الكائن للحصول على صورة واضحة في التركيز للخلايا. استخدم هدف 10X للعثور على خلايا مفردة متعددة مناسبة في ثلاثة شروط ، مثل خلية بها ميكروبيدات واحدة بداخلها ، مع ميكروبيدات متعددة بالداخل ، وبدون أي ميكروبيدات بالداخل. ثم قم بالتبديل إلى هدف 40X وقم بتسمية هذا الموضع برقم الموضع المناسب.
افتح العناصر ، وانقر فوق البحث المغناطيسي ، وقم بإزالة التعشيق ، ثم امسح علامات التبويب ضوئيا ، ثم حدد الزرين العلوي والسفلي لضبط موضع Z للمستوى البؤري لتعيين الحد الأدنى والأعلى لمكدس Z للخلايا المحددة. أوقف المسح الضوئي بالنقر فوق مسح ضوئي مرة أخرى. قم بالتبديل إلى تكوين نواة YAP المغناطيسي وقم بتعيين اسم الملف ك before_small_force.nd2.
انقر فوق زر التشغيل مع مكدس Z المسجل. قم بالتبديل إلى مسار الضوء الأيمن وقم بتشغيل DIA. افتح عرض الدوران وانقر على زر التسجيل.
حرك المغناطيس إلى 46 ملم فوق قاع طبق بتري عن طريق تدوير مقبض جهاز تحريك المغناطيس. احفظ الفيديو وتحقق منه للتأكد من إزاحة الميكروبيدات التي تسببها القوة المغناطيسية. كرر إجراء المسح عن طريق تعيين اسم الملف ك after_small_force.nd2.
بعد ذلك ، قم بالتبديل إلى مسار الضوء الأيمن ، وقم بتشغيل DIA وافتح عرض الدوران قبل النقر على زر التسجيل. قم بتدوير مقبض جهاز تحريك المغناطيس حتى 120 ملم فوق قاع طبق بتري واحفظ تسلسل صورة أو فيديو برايتفيلد. كرر خطوات المسح الضوئي عن طريق تعيين اسم الملف إلى before_large_force.nd2.
لا يمكن أن تنبعث الميكروبيدات من مضان تحت إثارة الليزر في قناة FITC أو السيانين 5. وهكذا ، تم تحديد الميكروبيدات الداخلية من خلال الجوف الداكن الموجود في التصوير البؤري لتألق البروتين والنواة المرتبطة ب YES. لم تظهر الدائرية النووية أي فرق كبير بين الخلايا الضابطة والخلايا ذات استيعاب الميكروبيدات.
كما لم تظهر نسبة نواة الخلية البروتينية إلى السيتوبلازم المرتبطة ب YES للخلايا الضابطة المستزرعة مع الميكروبيدات ولكن بدون استيعاب والخلايا ذات الاستيعاب الميكروبي أي فرق كبير. كان تشوه النواة وإزالة بلمرة الأكتين ناتجا عن قوة الضغط التي تطبقها الميكروبيدات في الخلايا المحتوية على الهيكل الخلوي. منحنى معايرة تحليل التصوير الكمي الذي توفره علاقة إزاحة قوة AFM الكمية.
بناء على هذه العلاقة ، تم تقدير القوة المطبقة على الخرزات. لوحظ تشوه النواة ونقل البروتين المرتبط ب YES عند التطبيق أو إطلاق القوة المغناطيسية. أكدت التغيرات الشديدة في البروتين المرتبط ب YES، في القناة الخضراء وعدم حدوث أي تغيير في تلطيخ النواة في القناة الحمراء، أن التشوه النووي الناجم عن القوة المغناطيسية الناجم عن إزفاء البروتين المرتبط ب YES.
أكد التحديد الكمي للتغير الصافي لنسبة نواة البروتين المرتبطة ب YES-to-cytoplasm داخل مجموعتين أن القوة المغناطيسية المطبقة على الميكروبيدات داخل السيتوبلازم أحدثت إزفاء البروتين المرتبط ب YES، وغيرت نسبة نواة البروتين المرتبطة ب YES. قبل تطبيق القوة والتصوير ، تأكد من أن الخلايا قد استوعبت الميكروبيدات المغناطيسية وأن الخرز داخل حدود الخلية.
