En este método, la fuerza se aplica directamente al núcleo. Esto desacopla el efecto de transmisión de fuerza de la membrana plasmática celular y el citoesqueleto, revelando los mecanismos moleculares de la mecanodetección nuclear. La fuerza se aplica dentro de las células vivas de una manera no invasiva.
En comparación con las pinzas ópticas, el campo magnético y la fuerza magnética no afectan las funciones de la célula y tienen un mayor rendimiento. Comience a cultivar las células con microperlas magnéticas pesando 0,2 gramos de microperlas de hierro carbonilo que tienen siete micrómetros de diámetro medio. Suspender las microperlas en un mililitro RPMI 1640 medio de cultivo utilizando una pipeta.
Luego lleve la placa de Petri con células B2B al gabinete de bioseguridad y agregue rápidamente 200 microlitros del medio que contiene microperlas en la placa de Petri. Coloque la placa de Petri en una incubadora hasta que las microperlas sean internalizadas por las células. Abra el microscopio invertido y, utilizando imágenes de fluorescencia confocal, determine el momento óptimo para la internalización de las líneas celulares cada seis horas visualizando la microperla, la nuclear y el límite celular.
Las microperlas internalizadas estarán presentes dentro del límite celular. Para aplicaciones de fuerza pequeña e imágenes de células vivas, abra la aplicación de software Elements. Para definir la búsqueda magnética de configuración, haga clic en el botón uno sobre dos para ajustar la velocidad de escaneo a un fotograma cada dos segundos.
Establezca el tamaño del agujero de alfiler en 1.2 Airy unit. Compruebe solo el canal FITC y establezca PMT HV como 70, offset como cero, intensidad láser como 10. Para definir la configuración magnética del núcleo YAP, establezca la velocidad de escaneo en un fotograma cada cuatro segundos haciendo clic en el botón uno sobre cuatro.
Luego haga clic en el botón de la unidad 1.2 Airy para establecer el tamaño del agujero de alfiler en la unidad 1.2 Airy y verifique el canal FIFC. Establezca PMT HV como 70, offset como cero, intensidad láser como 10. Para obtener imágenes del límite del núcleo y la intensidad de la tinción nuclear, verifique el canal 5 de cianina.
No haga clic en el botón de la unidad 1.2 Airy y ajuste PMT HV a 70, desplazamiento a cero e intensidad láser a 10. El tamaño del agujero de alfiler se optimizará para imágenes tridimensionales de proteínas asociadas a YES. A continuación, active el DIA a través de Elements.
Abra la vista de giro, use un campo claro y ajuste el enfoque del objeto para obtener una imagen clara de las celdas. Use un objetivo 10X para encontrar múltiples células individuales apropiadas en tres condiciones, como una célula con una sola microperla en el interior, con múltiples microperlas en el interior y sin ninguna microperla en el interior. Luego cambie al objetivo 40X y nombre esta posición con el número de posición apropiado.
Abra Elementos, haga clic en búsqueda magnética, elimine el enclavamiento, luego escanee las pestañas, luego seleccione los botones superior e inferior para ajustar la posición Z del plano focal para establecer el límite inferior y superior para la pila Z de las celdas seleccionadas. Detenga el escaneo haciendo clic en escanear nuevamente. Cambie a la configuración del núcleo YAP magnético y establezca el nombre de archivo como before_small_force.nd2.
Haga clic en el botón Ejecutar con la pila Z grabada. Cambie a la ruta de luz derecha y encienda DIA. Abra la vista de giro y haga clic en el botón de grabación.
Mueva el imán a 46 milímetros por encima del fondo de la placa de Petri girando la perilla del dispositivo móvil del imán. Guarde y revise el video para confirmar el desplazamiento de microperlas inducido por la fuerza magnética. Repita el procedimiento de escaneo estableciendo el nombre de archivo como after_small_force.nd2.
A continuación, cambie a la ruta de luz derecha, encienda DIA y abra la vista de giro antes de hacer clic en el botón de grabación. Gire la perilla del dispositivo móvil magnético hasta 120 milímetros por encima del fondo de la placa de Petri y guarde una secuencia de imagen o video de campo claro. Repita los pasos para escanear estableciendo el nombre de archivo en before_large_force.nd2.
Las microperlas no pueden emitir fluorescencia bajo excitación láser en el canal FITC o cianina 5. Por lo tanto, las microperlas internalizadas se identificaron por el hueco oscuro ubicado en la imagen confocal de fluorescencia de la proteína y el núcleo asociados a YES. La circularidad nuclear no mostró diferencias significativas entre las células de control y las células con internalización de microperlas.
La relación núcleo-citoplasma de células proteicas asociadas a SÍ de células control cocultivadas con microperlas pero sin internalización y células con internalización de microperlas tampoco mostró diferencias significativas. La deformación del núcleo y la despolimerización de la actina fueron causadas por la fuerza de compresión aplicada por las microperlas en las células que contienen citoesqueleto. La curva de calibración del análisis cuantitativo de imágenes proporcionada por la relación cuantitativa de desplazamiento de fuerza AFM.
Con base en esta relación, se estimó la fuerza aplicada por las perlas. La deformación del núcleo y la translocación de proteínas asociadas a SÍ se observaron en la aplicación o la liberación de la fuerza magnética. Los cambios de intensidad en la proteína asociada a SÍ en el canal verde y ningún cambio en la tinción del núcleo en el canal rojo confirmaron que la deformación nuclear inducida por la fuerza magnética desencadenada por la translocación de proteínas asociada a YES.
La cuantificación del cambio neto de la relación núcleo-citoplasma de proteína asociada a SÍ dentro de dos grupos confirmó que la fuerza magnética aplicada a las microperlas dentro del citoplasma indujo la translocación de proteínas asociada a SÍ y cambió la relación núcleo-citoplasma de proteína asociada a YES. Antes de aplicar fuerza e imágenes, asegúrese de que las células hayan internalizado las microperlas magnéticas y que las perlas estén dentro del límite celular.
