Neste método, a força é aplicada diretamente ao núcleo. Isso desacopla o efeito de transmissão de força da membrana plasmática celular e do citoesqueleto, revelando os mecanismos moleculares do mecanosense nuclear. A força é aplicada dentro das células vivas de forma não invasiva.
Em comparação com as pinças ópticas, o campo magnético e a força magnética não afetam as funções celulares e têm maior rendimento. Comece a cultivar as células com microesferas magnéticas pesando 0,2 gramas de microesferas de ferro carbonila com sete micrômetros de diâmetro médio. Suspenda as microesferas em um meio de cultura RPMI 1640 mililitro usando uma pipeta.
Em seguida, leve a placa de Petri com células B2B para o armário de biossegurança e adicione rapidamente 200 microlitros do meio contendo microesferas na placa de Petri. Coloque a placa de Petri em uma incubadora até que as microesferas sejam internalizadas pelas células. Abra o microscópio invertido e, usando imagens de fluorescência confocal, determine o tempo ideal para a internalização das linhagens celulares a cada seis horas, visualizando o limite de microesferas, nucleares e celulares.
As microesferas internalizadas estarão presentes dentro do limite celular. Para aplicativos de pequena força e imagens de células vivas, abra o aplicativo de software Elements. Para definir a configuração de localização magnética, clique no botão um sobre dois para definir a velocidade de digitalização para um quadro a cada dois segundos.
Defina o tamanho do orifício para 1,2 unidade Airy. Verifique apenas o canal FITC e defina PMT HV como 70, deslocado como zero, intensidade do laser como 10. Para definir o núcleo YAP magnético de configuração, defina a velocidade de digitalização para um quadro a cada quatro segundos clicando no botão um sobre quatro.
Em seguida, clique no botão da unidade 1.2 Airy para definir o tamanho do orifício para a unidade 1.2 Airy e verifique o canal FITC. Defina PMT HV como 70, deslocado como zero, intensidade do laser como 10. Para obter imagens do limite do núcleo e da intensidade da mancha nuclear, verifique o canal 5 da cianina 5.
Não clique no botão da unidade 1.2 Airy e defina PMT HV para 70, deslocamento para zero e intensidade do laser para 10. O tamanho do orifício será otimizado para imagens tridimensionais de proteínas associadas ao YES. Em seguida, ative o DIA por meio de Elementos.
Abra a visualização de rotação, use um campo brilhante e ajuste o foco do objeto para obter uma imagem clara em foco das células. Use um objetivo de 10X para encontrar várias células únicas apropriadas em três condições, como uma célula com uma única microesferas dentro, com várias microesferas dentro e sem nenhuma microesferas dentro. Em seguida, mude para a objetiva 40X e nomeie essa posição com o número de posição apropriado.
Abra Elementos, clique em localizar magnético, remova o intertravamento, digitalize as guias e selecione os botões superior e inferior para ajustar a posição Z do plano focal para definir o limite inferior e superior para a pilha Z das células selecionadas. Pare a digitalização clicando em Analisar novamente. Alterne para a configuração do núcleo magnético YAP e defina o nome do arquivo como before_small_force.nd2.
Clique no botão Executar com a pilha Z gravada. Alterne para o caminho da luz à direita e ligue o DIA. Abra a visualização de rotação e clique no botão de gravação.
Mova o ímã para 46 milímetros acima do fundo da placa de Petri girando o botão do dispositivo de movimento do ímã. Salve e verifique o vídeo para confirmar o deslocamento de microesferas induzido pela força magnética. Repita o procedimento de varredura definindo o nome do arquivo como after_small_force.nd2.
Em seguida, alterne para o caminho de luz à direita, ative o DIA e abra a visualização de rotação antes de clicar no botão de gravação. Gire o botão do dispositivo móvel do ímã até 120 milímetros acima da parte inferior da placa de Petri e salve uma sequência de imagens ou vídeos de campo brilhante. Repita as etapas de varredura definindo o nome do arquivo como before_large_force.nd2.
As microesferas não podem emitir fluorescência sob excitação a laser no canal FITC ou cianina 5. Assim, as microesferas internalizadas foram identificadas pelo oco escuro localizado na imagem confocal de fluorescência da proteína e núcleo associados ao YES. A circularidade nuclear não mostrou diferença significativa entre as células de controle e as células com internalização de microesferas.
A relação núcleo-citoplasma de células proteicas associadas ao YES de células de controle co-cultivadas com microesferas, mas sem internalização, e células com internalização de microesferas também não mostrou diferença significativa. A deformação do núcleo e a despolimerização da actina foram causadas pela força de compressão aplicada pelas microesferas em células contendo citoesqueleto. A curva de calibração da análise quantitativa de imagens fornecida pela relação quantitativa de deslocamento da força AFM.
Com base nessa relação, estimou-se a força aplicada das contas. A deformação do núcleo e a translocação proteica associada ao YES foram observadas na aplicação ou liberação da força magnética. As mudanças de intensidade na proteína associada ao SIM no canal verde e nenhuma alteração na coloração do núcleo no canal vermelho confirmaram que a deformação nuclear induzida pela força magnética desencadeada pela translocação de proteína associada ao YES.
A quantificação da mudança líquida da relação núcleo/citoplasma da proteína associada ao YES dentro de dois grupos confirmou que a força magnética aplicada às microesferas dentro do citoplasma induziu a translocação de proteínas associadas ao YES e alterou a relação núcleo-citoplasma da proteína associada ao YES. Antes de aplicar força e imagem, certifique-se de que as células internalizaram as microesferas magnéticas e as contas estão dentro do limite celular.
