我们改良的3D检测培养物可用于研究各种成分在癌症微环境中的作用，从而鉴定新的生物标志物和药物靶标。这种方法使人们能够研究与免疫系统非常相似的细胞表型和分子信号的变化。也可以对其进行修改以满足研究的特定要求。
这种方法可以帮助识别有助于早期发现乳腺癌的新型生物标志物。此外，分子见解可用于识别新的药物靶点。该方法可用于研究一个或多个基因扰动后的肿瘤发生和形态发生，从而深入了解基因或基因所起的作用。
首先，通过吸出培养基并用2毫升PBS洗涤来胰蛋白酶消化细胞。加入900微升0.05%胰蛋白酶-EDTA，在37摄氏度下孵育约15分钟或直到细胞完全胰蛋白酶消化。通过在腔盖玻片的八个孔中制备lrECM床，在每个孔中涂上60微升lrECM。
将其放入 37 摄氏度的二氧化碳培养箱中最多 15 分钟。为了制备细胞悬液，加入5毫升重悬培养基以淬灭胰蛋白酶活性，并在25摄氏度下以112倍g旋转细胞10分钟。吸出用过的培养基并将细胞重新悬浮在2毫升测定培养基中。
充分混合悬浮液以确保形成单细胞悬液。使用血细胞计数器计数细胞，并计算在每个孔中接种6， 000个细胞所需的细胞悬液体积。根据所需的孔数，在覆盖介质中稀释细胞悬液。
将400微升稀释的细胞悬液添加到准备好的lrECM床中，小心确保不会干扰lrECM床。在 37 摄氏度的加湿 5% 二氧化碳培养箱中孵育。3小时后，向每个孔中加入200纳摩尔的PAF。
在每次更换培养基时加入相同浓度的PAF，并每4天用新鲜培养基补充细胞。培养20天后，小心地从每个孔中移出培养基，并用400微升预热的PBS清洗孔。通过加入400微升新鲜制备的4%多聚甲醛并在室温下孵育20分钟来固定腺泡结构。
用冰冷的PBS冲洗孔一次，并用含有0.5%Triton X-100的PBS在4摄氏度下透化10分钟。10分钟后，小心移出Triton X-100溶液，并用400微升新鲜制备的PBS甘氨酸冲洗。在免疫荧光缓冲液中加入400微升含有10%山羊血清的主要封闭溶液，并在室温下孵育60分钟。
取出一级封闭溶液，加入在一级封闭溶液中制备的200微升2%二级封闭抗体，并在室温下放置45至60分钟。将一抗制备在 2% 二级封闭抗体溶液中，以 1：100 稀释度制备。取出二级封闭溶液，加入新鲜制备的抗体，并在4摄氏度下孵育过夜。
小心移液一抗溶液，并用400微升免疫荧光缓冲液洗涤三次。接下来，在一抗封闭溶液中制备1：200稀释的荧光团偶联二抗，并将载玻片在二抗溶液中在室温下孵育40至60分钟。用400微升免疫荧光缓冲液冲洗载玻片20分钟，然后用PBS洗涤两次，每次10分钟。
在室温下用含有每毫升0.5纳克核染色剂的PBS对细胞核进行复染5至6分钟。用400微升PBS清洗载玻片三次，以去除多余的污渍。小心地移出整个PBS，并确保去除残留的溶液。
然后在每个孔中加入一滴封片剂，使其在室温下静置过夜。最后，在共聚焦显微镜上以40倍或63倍放大倍率对载玻片进行成像，取0.6毫米步长的光学Z切片。这些图像代表用核染色的腺泡中细胞核。
这里显示了腺泡的3D结构和MCF10A腺泡在lrECM上生长20天的相差图像。最中间的部分显示了空心腔的存在。PAF破坏极性并诱导MCF10A乳腺腺泡的EMT样变化。
MCF10A细胞在lrECM的顶部培养物上以3D形式生长。培养物在第0、4、8、12和16天用PAF处理。将培养物维持20天，然后免疫染色α6-整合素和核染色，GM130（顶端极性标志物）和Vimentin（EMT标志物）。
此处显示了各个腺泡的最中心堆栈。代表性数据是来自三个生物学独立实验的40-50个腺泡。lrECM床需要仔细制作，使其均匀分布，没有任何气泡。
此外，细胞悬液应均匀混合并缓慢添加以避免结块。可以从3D培养物中获得蛋白质和RNA，然后可用于研究不同的分子途径。
