Modifiye edilmiş 3D tahlil kültürlerimiz, kanser mikro ortamındaki çeşitli bileşenlerin rolünü araştırmak için kullanılabilir ve bu da yeni biyobelirteçlerin ve ilaç hedeflerinin tanımlanmasına yol açar. Bu yöntem, bağışıklık sistemine çok benzeyen hücresel fenotipteki ve moleküler sinyallemedeki değişiklikleri incelemeyi sağlar. Bir etüdün özel gereksinimlerini karşılamak için de değiştirilebilir.
Bu yöntem, meme kanserinin erken teşhisine yardımcı olabilecek yeni biyobelirteçlerin tanımlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca, moleküler içgörüler yeni ilaç hedeflerini tanımlamak için kullanılabilir. Bu yöntem, gen veya genlerin oynadığı rol hakkında fikir verebilecek gen veya genlerin pertürbasyonundan sonra hem tümörigenezi hem de morfogenezi incelemek için kullanılabilir.
Başlamak için, ortamı aspire ederek ve 2 mililitre PBS ile yıkayarak hücreleri tripsinize edin. 900 mikrolitre% 0.05 Tripsin-EDTA ekleyin ve yaklaşık 15 dakika boyunca veya hücreler tamamen tripsinize olana kadar 37 santigrat derecede inkübe edin. Her bir kuyucuğu 60 mikrolitre lrECM ile kaplayarak odacıklı bir kapak camı kaydırağının sekiz kuyucuğunda bir lrECM yatağı hazırlayın.
En fazla 15 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Hücre süspansiyonunu hazırlamak için, tripsin aktivitesini söndürmek için 5 mililitre yeniden süspansiyon ortamı ekleyin ve hücreleri 25 santigrat derecede 10 dakika boyunca 112 kez g'de döndürün. Harcanan ortamı aspire edin ve hücreleri 2 mililitre tahlil ortamında yeniden askıya alın.
Tek hücreli bir süspansiyonun oluşumunu sağlamak için süspansiyonu iyice karıştırın. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve her bir kuyucukta 6.000 hücreyi tohumlamak için gereken hücre süspansiyonunun hacmini hesaplayın. Gerekli kuyu sayısına göre, hücre süspansiyonunu kaplama ortamında seyreltin.
Hazırlanan lrECM yataklarına 400 mikrolitre seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin ve lrECM yatağını rahatsız etmediğinizden emin olun. Nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede inkübe edin. 3 saat sonra, her bir kuyucuğa 200 nanomol PAF ekleyin.
Her ortam değişikliği sırasında aynı PAF konsantrasyonunu ekleyin ve hücreleri her 4 günde bir taze ortamla doldurun. 20 günlük kültürlemeden sonra, ortamı her bir kuyucuktan dikkatlice pipetleyin ve kuyucukları 400 mikrolitre önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. Acinar yapıları, 400 mikrolitre taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit ekleyerek ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe ederek sabitleyin.
Kuyucukları buz gibi soğuk PBS ile bir kez durulayın ve 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca% 0.5Triton X-100 içeren PBS ile geçirgenleştirin. 10 dakika sonra, Triton X-100 çözeltisini dikkatlice pipetleyin ve 400 mikrolitre taze hazırlanmış PBS glisin ile durulayın. İmmünofloresan tamponunda% 10 keçi serumu içeren birincil bloke edici çözeltinin 400 mikrolitresini ekleyin ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca inkübe edin.
Birincil blokaj çözeltisini çıkarın, birincil blokaj çözeltisinde hazırlanan 200 mikrolitre% 2 ikincil bloke edici antikor ekleyin ve 45 ila 60 dakika oda sıcaklığında bırakın. Primer antikoru %2 sekonder bloke edici antikor çözeltisinde 1:100 seyreltmede hazırlayın. İkincil blokaj çözeltisini çıkarın, taze hazırlanmış antikoru ekleyin ve gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin.
Birincil antikor çözeltisini dikkatlice pipetleyin ve 400 mikrolitre immünofloresan tamponu ile üç kez yıkayın. Daha sonra, birincil blokaj çözeltisinde florofor konjuge sekonjuge sekonder antikorun 1:200 seyreltilmesini hazırlayın ve slaytları ikincil antikor çözeltisinde oda sıcaklığında 40 ila 60 dakika inkübe edin. Slaytları 400 mikrolitre immünofloresan tamponu ile 20 dakika boyunca durulayın, ardından her biri 10 dakika boyunca PBS ile iki yıkama yapın.
Çekirdekleri, oda sıcaklığında 5 ila 6 dakika boyunca mililitre nükleer leke başına 0.5 nanogram içeren PBS ile karşı boyayın. Fazla lekeyi çıkarmak için slaytları üç kez 400 mikrolitre PBS ile yıkayın. Tüm PBS'yi dikkatlice pipetle çıkarın ve artık çözeltinin çıkarılmasını sağlayın.
Daha sonra her bir kuyucuğa bir damla montaj reaktifi ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında durmasına izin verin. Son olarak, slaytları konfokal mikroskopta 40x veya 63x büyütme altında görüntüleyerek 0,6 milimetre adım boyutunda optik Z-kesitleri alın. Görüntüler, nükleer bir leke ile boyanmış acini'deki hücrelerin çekirdeklerini temsil ediyor.
Acini'nin 3D yapısı ve 20 gün boyunca lrECM'de yetiştirilen MCF10A acini'nin faz kontrast görüntüsü burada gösterilmiştir. En ortadaki bölüm içi boş bir lümenin varlığını göstermektedir. PAF polariteyi bozar ve MCF10A meme akinisinde EMT benzeri değişikliklere neden olur.
MCF10A hücreleri, lrECM'de üst kültürlerde 3D olarak yetiştirildi. Kültürler 0, 4, 8, 12 ve 16. günlerde PAF ile tedavi edildi. Kültürler 20 gün boyunca korundu ve daha sonra alfa6-integrin ve nükleer boya, apikal polarite için bir belirteç olan GM130 ve bir EMT belirteci olan Vimentin için immünoboyalandı.
İlgili acini'nin en ortadaki yığını burada gösterilmiştir. Temsili veriler, biyolojik olarak bağımsız üç deneyden 40-50 acini içindir. LRCCM yatağının, herhangi bir hava kabarcığı olmadan eşit şekilde yayılacak şekilde dikkatlice yapılması gerekir.
Ayrıca, hücre süspansiyonu eşit şekilde karıştırılmalı ve kümelenmeyi önlemek için yavaşça eklenmelidir. Daha sonra farklı moleküler yolları araştırmak için kullanılabilecek 3B kültürlerden protein ve RNA elde edilebilir.
