Наши модифицированные 3D-культуры анализа могут быть использованы для исследования роли различных компонентов в микроокружении рака, что приводит к идентификации новых биомаркеров и мишеней лекарств. Этот метод позволяет изучать изменения в клеточном фенотипе и молекулярной сигнализации, которые очень похожи на иммунную систему. Он также может быть изменен в соответствии с конкретными требованиями исследования.
Этот метод может помочь идентифицировать новые биомаркеры, которые могут помочь в раннем выявлении рака молочной железы. Кроме того, молекулярные идеи могут быть использованы для выявления новых мишеней лекарств. Этот метод может быть использован для изучения как опухолевого, так и морфогенеза после возмущения гена или генов, которые могут дать представление о роли, которую играет ген или гены.
Для начала попробуйте клетки, аспирируя среду и промывая 2 миллилитрами PBS. Добавьте 900 микролитров 0,05% трипсина-ЭДТА и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение примерно 15 минут или до тех пор, пока клетки не будут полностью трипсинизированы. Подготовьте слой lrECM в восьми скважинах камерного покровного стекла, покрыв каждую скважину 60 микролитрами lrECM.
Поместите его в инкубатор углекислого газа при температуре 37 градусов Цельсия максимум на 15 минут. Чтобы приготовить клеточную суспензию, добавьте 5 миллилитров среды повторной суспензии, чтобы погасить активность трипсина и раскрутить клетки в 112 раз в течение 10 минут при 25 градусах Цельсия. Аспирируйте отработанную среду и повторно подвешивайте клетки в 2 миллилитрах пробирной среды.
Хорошо перемешайте суспензию, чтобы обеспечить образование одноклеточной суспензии. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для посева 6000 клеток в каждую лунку. В зависимости от количества необходимых лунок разбавляют клеточную суспензию в накладной среде.
Добавьте 400 микролитров разбавленной клеточной суспензии к подготовленным слоям lrECM, тщательно следя за тем, чтобы не нарушить слой lrECM. Инкубировать при температуре 37 градусов цельсия в увлажненном 5% инкубаторе углекислого газа. Через 3 часа добавьте 200 наномолей PAF в каждую лунку.
Добавляйте одинаковую концентрацию PAF во время каждого изменения среды и пополняйте клетки свежей средой каждые 4 дня. После 20 дней культивирования тщательно вытрите среду из каждой скважины и промыте скважины 400 микролитрами предварительно нагретого ПБС. Зафиксируйте ацинарные структуры, добавив 400 микролитров свежеприготовленного 4%-ного параформальдегида и инкубируя в течение 20 мин при комнатной температуре.
Промыть лунки один раз ледяным PBS и пермеабилизировать PBS, содержащим 0,5% Triton X-100 в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. Через 10 минут аккуратно вылейте раствор Triton X-100 и промойте 400 микролитрами свежеприготовленного глицина PBS. Добавьте 400 микролитров первичного блокирующего раствора, содержащего 10% козью сыворотку, в иммунофлуоресцентный буфер и инкубируйте при комнатной температуре в течение 60 минут.
Удалить первичный блокирующий раствор, добавить 200 микролитров 2% вторичного блокирующего антитела, приготовленного в первичном блокирующем растворе, и оставить его при комнатной температуре на 45-60 минут. Готовят первичное антитело в 2%-ном растворе вторичного блокирующего антитела в разведении 1:100. Удалите вторичный блокирующий раствор, добавьте свежеприготовленное антитело и инкубируйте в течение ночи при 4 градусах Цельсия.
Осторожно пипетку раствора первичного антитела и трижды промыть его 400 микролитрами иммунофлуоресцентного буфера. Затем готовят разведение флуорофорно-конъюгированного вторичного антитела в 1:200 в первичном блокирующем растворе и инкубируют слайды в растворе вторичного антитела в течение 40-60 минут при комнатной температуре. Промойте слайды 400 микролитрами иммунофлуоресцентного буфера в течение 20 минут, затем две промывки PBS в течение 10 минут каждая.
Противопоставьте ядра PBS, содержащим 0,5 нанограмма на миллилитр ядерного пятна, в течение 5-6 минут при комнатной температуре. Трижды вымойте слайды 400 микролитрами PBS, чтобы удалить лишнее пятно. Аккуратно выложите всю PBS и обеспечьте удаление остаточного раствора.
Затем добавьте по одной капле монтажного реагента в каждую лунку и дайте ей постоять при комнатной температуре в течение ночи. Наконец, изобразите слайды под 40-кратным или 63-кратным увеличением на конфокальном микроскопе, взяв оптические Z-сечения размером шага 0,6 миллиметра. Изображения представляют собой ядра клеток в ацинусах, окрашенных ядерным пятном.
3D-конструкция ацини и фазоконтрастное изображение MCF10A acini, выращенное на lrECM в течение 20 дней, показаны здесь. Самый центральный участок показывает наличие полого просвета. PAF нарушает полярность и индуцирует EMT-подобные изменения в MCF10A ацинусах молочной железы.
Клетки MCF10A выращивали в виде 3D на верхних культурах в lrECM. Культуры обрабатывали PAF на 0, 4, 8, 12 и 16 день. Культуры поддерживали в течение 20 дней, а затем иммуноокрашивали для альфа6-интегрина и ядерного пятна, GM130, маркера апикальной полярности, и виментина, маркера EMT.
Здесь показан самый центральный стек соответствующих ацин. Репрезентативные данные относятся к 40-50 ацини из трех биологически независимых экспериментов. Кровать lrECM должна быть сделана аккуратно, чтобы она равномерно распределялась без каких-либо пузырьков воздуха.
Кроме того, клеточную суспензию следует смешивать равномерно и добавлять медленно, чтобы избежать слипания. Можно получить белок и РНК из 3D-культур, которые затем могут быть использованы для исследования различных молекулярных путей.
