ניתן להשתמש בתרביות הבדיקה התלת-ממדיות המותאמות שלנו כדי לחקור את תפקידם של רכיבים שונים במיקרו-סביבה של סרטן, מה שמוביל לזיהוי סמנים ביולוגיים חדשים ומטרות של תרופות. שיטה זו מאפשרת לחקור שינויים בפנוטיפ התאי ובאיתות המולקולרי הדומים מאוד למערכת החיסון. ניתן גם לשנות אותו כדי לעמוד בדרישות ספציפיות של מחקר.
שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי סמנים ביולוגיים חדשים שיכולים לסייע בגילוי מוקדם של סרטן השד. כמו כן, ניתן להשתמש בתובנות מולקולריות לזיהוי מטרות תרופות חדשות. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור הן גידולים והן מורפוגנזה לאחר הפרעה של גנים או גנים שיכולים לספק תובנה לגבי התפקיד שממלאים הגן או הגנים.
כדי להתחיל, trypsinize את התאים על ידי שאיפה המדיום לשטוף עם 2 מיליליטר של PBS. יש להוסיף 900 מיקרוליטרים של 0.05% טריפסין-EDTA ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-15 דקות או עד שהתאים עוברים טריפסינליזציה מלאה. הכינו מצע של lrECM בשמונה בארות של שקופית זכוכית עם כיסוי קאמרית על ידי ציפוי כל באר ב-60 מיקרוליטרים של lrECM.
מניחים אותו באינקובטור פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לכל היותר. כדי להכין את תרחיף התאים, הוסף 5 מיליליטר של מדיום ההשעיה מחדש כדי להרוות את פעילות הטריפסין ולסובב את התאים ב 112 פעמים g במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. לשאוף את המדיום בילה להשעות מחדש את התאים ב 2 מיליליטר של מדיום בדיקה.
מערבבים היטב את המתלים כדי להבטיח היווצרות של השעיה של תא בודד. לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולחשב את נפח ההשעיה התא הדרוש כדי לזרוע 6, 000 תאים בכל באר. על פי מספר הבארות הנדרשות, לדלל את השעיית התא במדיום הכיסוי.
הוסף 400 מיקרוליטרים של מתלה התאים המדולל למיטות lrECM המוכנות, תוך הקפדה קפדנית שלא להפריע למיטת lrECM. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס בחממה לחה של 5% פחמן דו-חמצני. לאחר 3 שעות, הוסף 200 ננומולים של PAF לכל באר.
הוסיפו את אותו ריכוז של PAF במהלך כל שינוי מדיה, ומלאו את התאים במדיום טרי כל 4 ימים. לאחר 20 יום של תרבות, בזהירות pipette החוצה את המדיום מכל באר ולשטוף את הבארות עם 400 microliters של PBS מחומם מראש. תקן את מבני האסינאר על ידי הוספת 400 מיקרוליטרים של 4% פרפורמלדהיד טריים ודגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
שטפו את הבארות פעם אחת עם PBS קר כקרח וחלחלו עם PBS המכיל 0.5% Triton X-100 למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות, הוציאו את תמיסת Triton X-100 בזהירות ושטפו עם 400 מיקרוליטר של גליצין PBS טרי. הוסיפו 400 מיקרוליטרים של תמיסת החסימה העיקרית הכוללת סרום 10% עזים במאגר אימונופלואורסצנטי ודגרה בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות.
הסר את פתרון החסימה הראשי, הוסף 200 מיקרוליטרים של נוגדן חוסם משני 2% שהוכן בתמיסת החסימה הראשונית, והשאר אותו בטמפרטורת החדר למשך 45 עד 60 דקות. הכינו את הנוגדן העיקרי בתמיסת נוגדן חוסם משנית ב-2% בדילול של 1:100. הסר את תמיסת החסימה המשנית, הוסף את הנוגדן המוכן טרי, ודגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
בזהירות פיפטה תמיסת הנוגדנים העיקרית ולשטוף אותו שלוש פעמים עם 400 microliters של חיץ immunofluorescence. לאחר מכן, הכינו דילול של 1:200 של הנוגדן המשני המצומד לפלואורופור בתמיסת החסימה הראשונית ודגרו את השקופיות בתמיסת הנוגדנים המשנית למשך 40 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות עם 400 מיקרוליטרים של חיץ אימונופלואורסצנטי במשך 20 דקות, ולאחר מכן שתי שטיפות עם PBS במשך 10 דקות כל אחת.
הכתימו את הגרעינים ב-PBS המכיל 0.5 ננוגרם למיליליטר של כתם גרעיני למשך 5 עד 6 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם 400 מיקרוליטר של PBS כדי להסיר את הכתם העודף. בזהירות pipette החוצה את כל PBS ולהבטיח הסרת הפתרון שיורי.
לאחר מכן הוסיפו טיפה אחת של מגיב הרכבה לכל באר ואפשרו לה לעמוד בטמפרטורת החדר למשך הלילה. לבסוף, צלם את השקופיות תחת הגדלה של 40x או 63x במיקרוסקופ קונפוקלי, תוך צילום קטעי Z אופטיים בגודל צעד של 0.6 מילימטר. התמונות מייצגות את גרעיני התאים באסיני המוכתמים בכתם גרעיני.
הבנייה התלת-ממדית של האצ'יני ותמונת ניגודיות הפאזה של MCF10A acini שגדלה על lrECM במשך 20 יום מוצגות כאן. החלק המרכזי ביותר מראה נוכחות של לומן חלול. PAF משבש את הקוטביות וגורם לשינויים דמויי EMT באציני שד MCF10A.
תאי MCF10A גודלו כתלת-ממד בתרביות עליונות ב-lrECM. התרביות טופלו ב-PAF ביום 0, 4, 8, 12 ו-16. התרביות נשמרו במשך 20 יום ולאחר מכן הוכתמו עבור אלפא-אינטגרין וכתם גרעיני, GM130, סמן לקוטביות אפית, ווימנטין, סמן EMT.
הערימה המרכזית ביותר של האצ'יני בהתאמה הוצגה כאן. הנתונים המייצגים הם עבור 40-50 acini משלושה ניסויים בלתי תלויים ביולוגית. מיטת lrECM צריכה להיות עשויה בקפידה כך שהיא מפוזרת באופן שווה ללא בועות אוויר.
כמו כן, יש לערבב את השעיית התא באופן שווה ולהוסיף אותה באיטיות כדי למנוע גושים. אפשר לקבל חלבון ורנ"א מהתרביות התלת-ממדיות שבהן ניתן להשתמש כדי לחקור את המסלולים המולקולריים השונים.
