Nossas culturas modificadas de ensaio 3D podem ser usadas para investigar o papel de vários componentes em um microambiente de câncer, levando à identificação de novos biomarcadores e alvos de drogas. Este método permite estudar mudanças no fenótipo celular e sinalização molecular que se assemelham muito ao sistema imunológico. Também pode ser modificado para atender a requisitos específicos de um estudo.
Este método pode ajudar a identificar novos biomarcadores que podem ajudar na detecção precoce do câncer de mama. Além disso, insights moleculares podem ser utilizados para identificar novos alvos de drogas. Este método pode ser usado para estudar tanto a tumorigênese quanto a morfogênese após perturbação de genes ou genes que podem fornecer insights sobre o papel desempenhado pelo gene ou genes.
Para começar, tentepsinizar as células aspirando o meio e lavando com 2 mililitros de PBS. Adicione 900 microliters de 0,05% Trypsin-EDTA e incubar a 37 graus Celsius por cerca de 15 minutos ou até que as células sejam completamente experimentadas. Prepare uma cama de lrECM em oito poços de um escorregador de vidro de cobertura de câmara, revestindo cada poço com 60 microliters de lrECM.
Coloque-o em uma incubadora de dióxido de carbono Celsius de 37 graus por um máximo de 15 minutos. Para preparar a suspensão da célula, adicione 5 mililitros de meio de suspensão para saciar a atividade de trippsina e gire as células a 112 vezes g por 10 minutos a 25 graus Celsius. Aspire o meio gasto e suspenda as células em 2 mililitros de meio de ensaio.
Misture bem a suspensão para garantir a formação de uma única suspensão celular. Conte as células usando um hemótmetro e calcule o volume de suspensão celular necessária para semear 6.000 células em cada poço. De acordo com o número de poços necessários, diluir a suspensão celular no meio de sobreposição.
Adicione 400 microliters da suspensão celular diluída aos leitos LrECM preparados, garantindo cuidadosamente não perturbar a cama lrECM. Incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono umidificada de 5%. Depois de 3 horas, adicione 200 nanomoles de PAF a cada poço.
Adicione a mesma concentração de PAF durante cada mudança de mídia, e reponha as células com meio fresco a cada 4 dias. Após 20 dias de cultivo, cuidadosamente pipeta o meio de cada poço e lave os poços com 400 microliters de PBS pré-aquecido. Fixar as estruturas acinar adicionando 400 microlitadores de 4% de paraformaldeído recém-preparado e incubando por 20 minutos à temperatura ambiente.
Enxágüe os poços uma vez com PBS gelado e permeabilize com PBS contendo 0,5% Triton X-100 por 10 minutos a 4 graus Celsius. Após 10 minutos, pipete a solução Triton X-100 cuidadosamente e enxágue com 400 microliters de glicina PBS recém-preparada. Adicione 400 microliters da solução de bloqueio primário que compreende 10% soro de cabra no tampão de imunofluorescência e incubar à temperatura ambiente por 60 minutos.
Remova a solução de bloqueio primário, adicione 200 microlitadores de anticorpo de bloqueio secundário de 2% preparado na solução de bloqueio primário e deixe-o em temperatura ambiente por 45 a 60 minutos. Prepare o anticorpo primário em solução de anticorpos de bloqueio secundário de 2% em uma diluição de 1:100. Remova a solução de bloqueio secundário, adicione o anticorpo recém-preparado e incuba durante a noite a 4 graus Celsius.
Pipete cuidadosamente a solução de anticorpos primários e lave-a três vezes com 400 microlitres de tampão de imunofluorescência. Em seguida, prepare uma diluição de 1:200 do anticorpo secundário conjugado por fluorohore na solução de bloqueio primário e incubar os slides na solução de anticorpos secundários por 40 a 60 minutos à temperatura ambiente. Enxágüe os slides com 400 microliters de tampão de imunofluorescência por 20 minutos, seguido por duas lavagens com PBS por 10 minutos cada.
Contra-colori a contrapernadeira dos núcleos com PBS contendo 0,5 nanogramas por mililitro de mancha nuclear por 5 a 6 minutos em temperatura ambiente. Lave os slides três vezes com 400 microliters de PBS para remover o excesso de mancha. Pipeta cuidadosamente toda a PBS e garanta a remoção da solução residual.
Em seguida, adicione uma gota de reagente de montagem em cada poço e deixe-o ficar em temperatura ambiente durante a noite. Finalmente, imagem os slides sob ampliação de 40x ou 63x em um microscópio confocal, tomando seções ópticas Z de tamanho de passo de 0,6 milímetros. As imagens representam os núcleos de células em acini manchadas com uma mancha nuclear.
A construção 3D do acini e a imagem de contraste de fase do MCF10A acini cultivada na LrECM por 20 dias são mostradas aqui. A seção mais central mostra a presença de um lúmen oco. O PAF interrompe a polaridade e induz alterações semelhantes ao EMT no acini mamário MCF10A.
As células MCF10A foram cultivadas como 3D nas culturas superiores no IrECM. As culturas foram tratadas com PAF nos dias 0, 4, 8, 12 e 16. As culturas foram mantidas por 20 dias e, em seguida, imunossuídas para alfa6-integrin e mancha nuclear, GM130, um marcador para polaridade apical, e Vimentin, um marcador DET.
A pilha mais central do respectivo acini foi mostrada aqui. Os dados representativos são de 40-50 acini de três experimentos biologicamente independentes. A cama LrECM precisa ser feita com cuidado para que seja uniformemente espalhada sem bolhas de ar.
Além disso, a suspensão da célula deve ser misturada uniformemente e adicionada lentamente para evitar a aglomeração. Pode-se obter proteína e RNA das culturas 3D que podem então ser usadas para investigar as diferentes vias moleculares.
