具有稳定荧光线粒体的永生化肾小球内皮细胞是体外检查不同刺激对线粒体结构影响的好工具。本文中描述的方法产生大量的肾小球内皮细胞。通过在GEC上测试小分子，我们可以筛查GEC受到影响的糖尿病肾病的单一疗法。
所描述的方法易于执行，不需要特定的设备。但是，重要的是要遵循所述步骤并对设备进行消毒以避免污染。首先，将分离肾小球细胞所需的灌注和分离材料放置在工作空间上。
用0.2微米的过滤器过滤新鲜制备的汉克斯平衡盐溶液（HBSS），并将其放在引擎盖下以避免污染。然后，将200微升磁珠与20毫升HBSS混合。用10%FCS和内皮细胞培养基在37摄氏度的水浴中预热RPMI。
然后，在室温下用两毫升每毫升10微克胶原蛋白IV预涂六孔板的两个孔45分钟。用PBS清洗盘子两次，以去除用于稀释胶原蛋白的乙酸。立即使用涂层板，或将其在 2 到 8 摄氏度下存放长达四周。
用70%乙醇清洁手术器械和工作空间。随后，将手术器械高压灭菌30分钟。打开麻醉小鼠的腹部后，将蝶针插入左心室。
要注射100微升珠溶液以扩大血液循环，请小心地用19号针头打破肾脏下方的下腔静脉，并继续灌注珠溶液。接下来，用镊子轻轻去除脂肪组织，用细手术剪刀C切除两个肾脏，然后将它们放在装有一毫升HBSS的冰板上。用无菌手术刀将肾脏切成一毫米的小块。
将切碎的肾脏与一毫米新鲜制备的II型胶原酶在37摄氏度下孵育35分钟，并在水平摇床上轻轻倾斜。消化后，加入四毫升含有10%FBS的RPMI以中和胶原酶。通过无菌的100微米细胞过滤器将消化的组织过滤到50毫升管中。
使用无菌 1.5 毫升管的底部将消化的组织搅拌到过滤器上，让肾小球通过。用15毫升HBSS冲洗细胞过滤器。然后，在室温下以200 XG离心流过五分钟。
在这个阶段，管子包含三层。上层包含较小的结构，例如小管，中间层是带有肾小球的珠子，底层包含碎片。小心地吸出上清液和顶部白色层。
然后，将含有带有肾小球和碎片的珠子的沉淀重悬于1.5毫升HBSS中，并将其转移到两毫升管中。将管放入磁性浓缩器中并吸出上清液，然后用一毫升HBSS洗涤珠子两次。将20微升细胞悬液放在载玻片上。
然后，在显微镜下观察载玻片是否存在肾小球。接下来，将沉淀重悬于内皮细胞生长培养基中，并将悬浮液转移到两毫升管中。每三毫升培养基加入一微升干扰素γ，并将细胞置于六孔板中，在33摄氏度下孵育。
培养三天后，小心地用新鲜培养基替换一毫升培养基。在这个阶段，细胞是异质的，混合了肾小球细胞。七天后，用两毫升新鲜内皮细胞生长培养基替换培养基，补充干扰素γ以开始细胞增殖。
10天后，当细胞达到80%汇合时，使用胰蛋白酶传代它们并将其转移到涂有胶原蛋白IV的T-25烧瓶中.培养21天后，将细胞转移到T-75烧瓶中。将三毫升0.25%胰蛋白酶加入T-75烧瓶中，并将细胞在37摄氏度下孵育五分钟。然后，用三毫升内皮生长培养基中和胰蛋白酶，并将悬浮液转移到15毫升管中，以200XG离心五分钟。
吸出上清液并在含有1%BSA，2毫摩尔EDTA，1%青霉素/链霉素的一毫升PBS中洗涤细胞。再次，将沉淀离心并重悬于200微升CD31抗体包被的珠子和800微升PBS中。将细胞孵育45分钟，在37摄氏度和5%二氧化碳下连续振荡。
接下来，将试管放入磁浓缩器中，并用含有BSA，EDTA和青霉素/链霉素的PBS洗涤细胞四次。最后一次洗涤后，将细胞重悬于三毫升内皮生长培养基中，补充有干扰素γ。在六孔板上的胶原蛋白IV包被孔中每孔板1.5毫升细胞，并在33摄氏度的许可条件下培养。
四天后，用新鲜的内皮生长培养基替换750微升培养基，并补充干扰素γ。培养10至14天后，使用带有488纳米过滤器的落射荧光显微镜，观察生长的CD31阳性肾小球内皮细胞或GECs，表达荧光线粒体的集落。21天后，或当细胞达到80%至90%汇合时，将它们转移到T-25烧瓶中。
用含有10%FCS的RPMI生长培养基维持培养物。或者，细胞可以冷冻保存。如前所述，使用胰蛋白酶传代细胞。
然后，离心细胞并将沉淀重悬于三毫升冷冻培养基中。将细胞分装在冷冻管中，并将其储存在液氮，蒸气温度下。该协议描述了一种分离肾小球内皮细胞的方法。
从分离的肾小球开始，细胞在培养三天后开始缓慢生长。七天后，细胞出现异质性，并显示其他肾小球细胞类型，如足细胞、壁细胞、上皮细胞和系膜细胞。在达到70%至80%汇合度后，使用阳性选择的内皮细胞去除其他肾小球细胞。
MitoDendra2 GEC表达CD31并且足细胞标志物呈阴性，如突触足素阴性染色所示。检查葡萄糖浓度对线粒体结构的影响。与正常葡萄糖下细胞中可见的细长线粒体相比，高葡萄糖诱导线粒体碎裂或裂变，如突出的球状线粒体所观察到的那样。
此外，使用405纳米激光在单个活的MitoDendra2 GEC中光转换选定的线粒体亚群。显示了线粒体在正常和高葡萄糖浓度处理细胞的选定区域中从绿色到红色的成功光转换。这种切换允许见证MitoDendra2 GEC中的聚变事件。
在正常葡萄糖下，由于线粒体基质融合，观察到黄色合并的绿色和红色荧光。相反，在高葡萄糖处理的GEC中，线粒体主要是碎片化的。将细胞放置在一个带有少量生长培养基的六孔板中对于让细胞附着在培养皿上至关重要。
分离的内皮细胞可用于进行线粒体功能和结构研究。使用具有荧光线粒体特征的永生化内皮细胞将为药物发现铺平道路。可以在细胞上测试小分子，并进行实时成像以检查它们对线粒体功能的影响。
