Las células endoteliales glomerulares inmortalizadas con mitocondrias fluorescentes estables son una gran herramienta para examinar el efecto de diferentes estímulos sobre la estructura mitocondrial in vitro. El método descrito en el presente artículo produce un alto número de células endoteliales glomerulares. Al probar moléculas pequeñas en un GEC, podríamos detectar la monoterapia para la enfermedad renal diabética donde los GEC se ven afectados.
El método descrito es fácil de realizar y no requiere equipo específico. Sin embargo, es importante seguir los pasos descritos y esterilizar el equipo para evitar la contaminación. Para comenzar, coloque los materiales de perfusión y aislamiento necesarios para aislar las células glomerulares renales en un espacio de trabajo.
Filtre la solución salina recién preparada de Hanks'Balanced, o HBSS, con un filtro de 0,2 micras, y manténgala debajo del capó para evitar la contaminación. Luego, mezcle 200 microlitros de perlas magnéticas con 20 mililitros de HBSS. Precaliente el RPMI con FCS al 10% y medio de cultivo de células endoteliales en un baño de agua a 37 grados centígrados.
Luego, recubra previamente dos pocillos de una placa de seis pocillos con dos mililitros de 10 microgramos por mililitro de colágeno IV durante 45 minutos a temperatura ambiente. Lave la placa dos veces con PBS para eliminar el ácido acético utilizado para diluir el colágeno. Use las placas recubiertas inmediatamente, o guárdelas a dos a ocho grados centígrados durante un máximo de cuatro semanas.
Limpie los instrumentos quirúrgicos y el espacio de trabajo con etanol al 70%. Posteriormente, autoclave los instrumentos quirúrgicos durante 30 minutos. Después de abrir el abdomen de un ratón anestesiado, inserte una aguja de mariposa en el ventrículo izquierdo.
Para inyectar 100 microlitros de la solución de perlas para expandir la circulación sanguínea, rompa cuidadosamente la vena cava inferior debajo de los riñones con una aguja de calibre 19 y continúe la perfusión de la solución de perlas. A continuación, retire suavemente el tejido graso con pinzas, extirpe ambos riñones con tijeras quirúrgicas delgadas C y colóquelos en un plato con un mililitro de HBSS en hielo. Picar el riñón con un bisturí estéril en trozos pequeños de un milímetro.
Incubar el riñón picado con un milímetro de colagenasa tipo II recién preparada durante 35 minutos a 37 grados centígrados con una suave inclinación sobre una coctelera horizontal. Después de la digestión, agregue cuatro mililitros de RPMI con 10% FBS para neutralizar la colagenasa. Filtre el tejido digerido a través de un colador de células estéril de 100 micras en un tubo de 50 mililitros.
Use el fondo de un tubo estéril de 1.5 mililitros para agitar el tejido digerido contra el colador, permitiendo que los glomérulos pasen. Enjuague el colador celular con 15 mililitros de HBSS. Luego, centrifugar el flujo a 200 XG durante cinco minutos a temperatura ambiente.
En esta etapa, el tubo contiene tres capas. La capa superior contiene estructuras más pequeñas como túbulos, la capa intermedia son cuentas con glomérulos y la capa inferior contiene desechos. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y la capa blanca superior.
Luego, vuelva a suspender el pellet que contiene perlas que llevan los glomérulos y los desechos en 1.5 mililitros de HBSS y transfiéralo a un tubo de dos mililitros. Coloque el tubo en un concentrador magnético y aspire el sobrenadante antes de lavar las perlas dos veces con un mililitro de HBSS. Coloque 20 microlitros de suspensión celular en un portaobjetos.
Luego, observe el portaobjetos bajo un microscopio para detectar la presencia de glomérulos. A continuación, resuspenda el pellet en un medio de crecimiento celular endotelial y transfiera la suspensión a un tubo de dos mililitros. Agregue un microlitro de interferón gamma por cada tres mililitros de medio, y coloque las células en una placa de seis pocillos para incubar a 33 grados centígrados.
Después de tres días de cultivo, reemplace cuidadosamente el medio de un mililitro con un medio fresco. En esta etapa, las células son heterogéneas con una mezcla de células glomerulares. Después de siete días, reemplace el medio con dos mililitros de medio de crecimiento de células endoteliales frescas, complementado con interferón gamma para iniciar la proliferación de las células.
Después de 10 días, cuando las células alcancen el 80% de confluencia, pasarlas usando tripsina y transferirlas a un matraz T-25 recubierto con colágeno IV.Después de 21 días de cultivo, transferir las células a un matraz T-75. Añadir tres mililitros de tripsina al 0,25% a un matraz T-75 e incubar las células a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Luego, neutralice la tripsina con tres mililitros de medio de crecimiento endotelial y transfiera la suspensión a un tubo de 15 mililitros para centrifugación a 200 XG durante cinco minutos.
Aspirar el sobrenadante y lavar las células en un mililitro de PBS que contenga 1% BSA, EDTA de dos milimolares, 1% de penicilina/estreptomicina. Nuevamente, centrifugar y resuspender el pellet en 200 microlitros de perlas recubiertas de anticuerpos CD31 y 800 microlitros de PBS. Incubar las células durante 45 minutos con agitación continua a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Luego, coloque el tubo en el concentrador magnético y lave las celdas cuatro veces con PBS que contenga BSA, EDTA y penicilina/estreptomicina. Después del último lavado, resuspender las células en tres mililitros de medio de crecimiento endotelial, complementado con interferón gamma. Placa 1,5 mililitros de células por pocillo en pocillos recubiertos de colágeno IV en una placa de seis pocillos y cultivo en condiciones permisivas a 33 grados centígrados.
Después de cuatro días, reemplace 750 microlitros del medio con un medio de crecimiento endotelial fresco, complementado con interferón gamma. Después de 10 a 14 días de cultivo, utilizando un microscopio de epifluorescencia con un filtro de 488 nanómetros, observe el crecimiento de células endoteliales glomerulares CD31 positivas, o GEC, colonias que expresan mitocondrias fluorescentes. Después de 21 días, o cuando las células hayan alcanzado el 80 al 90% de confluencia, transferirlas a un matraz T-25.
Mantener el cultivo con un medio de crecimiento RPMI que contenga 10% de FCS. Alternativamente, las células pueden ser criopreservadas. Células de paso usando tripsina, como se demostró anteriormente.
Luego, centrifuga las células y resuspende el pellet en tres mililitros de medio de congelación. Alícuota las células en tubos criogénicos y almacénelas en nitrógeno líquido, temperatura de vapor. Este protocolo describió un método para el aislamiento de células endoteliales glomerulares.
A partir de los glomérulos aislados, las células comenzaron a crecer lentamente después de tres días de cultivo. Después de siete días, las células parecían heterogéneas y mostraban otros tipos de células glomerulares, como podocitos, parietales, epiteliales y mesangiales. Después de alcanzar una confluencia del 70 al 80%, se eliminaron otras células glomerulares utilizando una selección positiva de células endoteliales.
Los GEC de MitoDendra2 expresaron CD31 y fueron negativos para el marcador de podocitos, como se muestra en la tinción negativa de sinaptopodina. Se examinó el efecto de la concentración de glucosa en la estructura de las mitocondrias. En comparación con las mitocondrias alargadas visibles en las células bajo glucosa normal, la glucosa alta indujo fragmentación o fisión de las mitocondrias, como se observa en las mitocondrias prominentes en forma de esferoide.
Además, se utilizó un láser de 405 nanómetros para fotoconvertir una subpoblación seleccionada de mitocondrias en un solo GEC vivo de MitoDendra2. Se muestra un fotocambio exitoso de las mitocondrias de verde a rojo en el área seleccionada para las células tratadas con concentración normal y alta de glucosa. Este cambio permitió presenciar los eventos de fusión en los GEC MitoDendra2.
Bajo glucosa normal, se observó fluorescencia verde y roja amarilla combinada debido a la fusión de la matriz mitocondria. En contraste, en los GEC tratados con alta glucosa, las mitocondrias estaban principalmente fragmentadas. Colocar las células en un pocillo de placa de seis pocillos con un pequeño volumen de medio de crecimiento es esencial para permitir que las células se adhieran al plato.
Las células endoteliales aisladas podrían usarse para realizar estudios estructurales y de función mitocondrial. El uso de células endoteliales inmortalizadas con características mitocondriales fluorescentes allanará el camino hacia el descubrimiento de fármacos. Las moléculas pequeñas podrían probarse en las células, y se realizan imágenes en vivo para examinar su efecto sobre la función de las mitocondrias.
