تعد الخلايا البطانية الكبيبية الخالدة ذات الميتوكوندريا الفلورية المستقرة أداة رائعة لفحص تأثير المحفزات المختلفة على بنية الميتوكوندريا في المختبر. الطريقة الموصوفة في المقالة الحالية تنتج عددا كبيرا من الخلايا البطانية الكبيبية. من خلال اختبار جزيئات صغيرة على GEC ، يمكننا فحص العلاج الأحادي لمرض الكلى السكري حيث تتأثر GECs.
الطريقة الموصوفة سهلة التنفيذ ولا تتطلب معدات محددة. ومع ذلك ، من المهم اتباع الخطوات الموضحة وتعقيم المعدات لتجنب التلوث. للبدء ، ضع مواد التروية والعزل المطلوبة لعزل الخلايا الكبيبية في الكلى في مساحة العمل.
قم بتصفية محلول الملح المتوازن من هانكس الطازج ، أو HBSS ، بفلتر 0.2 ميكرون ، واحتفظ به تحت الغطاء لتجنب التلوث. ثم امزج 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي مع 20 ملليلتر من HBSS. قم بتسخين RPMI باستخدام 10٪ FCS ووسط زراعة الخلايا البطانية في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
بعد ذلك ، قم بتغطية بئرين من صفيحة من ستة آبار مسبقا بمليلين من 10 ميكروغرام لكل ملليلتر كولاجين IV لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل اللوحة مرتين باستخدام PBS لإزالة حمض الأسيتيك المستخدم لتخفيف الكولاجين. استخدم الألواح المطلية على الفور ، أو قم بتخزينها في درجتين إلى ثماني درجات مئوية لمدة تصل إلى أربعة أسابيع.
نظف الأدوات الجراحية ومساحة العمل باستخدام 70٪ إيثانول. في وقت لاحق ، الأوتوكلاف الأدوات الجراحية لمدة 30 دقيقة. بعد فتح بطن فأر مخدر ، أدخل إبرة فراشة في البطين الأيسر.
لحقن 100 ميكرولتر من محلول الخرزة لتوسيع الدورة الدموية ، قم بكسر الوريد الأجوف السفلي أسفل الكلى بعناية بإبرة قياس 19 واستمر في نضح محلول الخرزة. بعد ذلك ، قم بإزالة الأنسجة الدهنية برفق باستخدام ملاقط ، واستأصل كلتا الكليتين بمقص جراحي رفيع C ، وضعها على طبق مع ملليلتر واحد من HBSS على الجليد. اللحم المفروم الكلى مع مشرط معقم إلى قطع صغيرة ملليمتر واحد.
احتضان الكلى المفرومة مع ملليمتر واحد من كولاجيناز من النوع الثاني الطازج لمدة 35 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع إمالة لطيفة على شاكر أفقي. بعد الهضم ، أضف أربعة ملليلتر من RPMI مع 10٪ FBS لتحييد الكولاجيناز. قم بتصفية الأنسجة المهضومة من خلال مصفاة خلية معقمة 100 ميكرون في أنبوب سعة 50 ملليلتر.
استخدم الجزء السفلي من أنبوب معقم سعة 1.5 ملليلتر لتحريك الأنسجة المهضومة ضد المصفاة ، مما يسمح للكبيبات بالمرور. شطف مصفاة الخلية مع 15 ملليلتر من HBSS. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للتدفق بسرعة 200 XG لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
في هذه المرحلة ، يحتوي الأنبوب على ثلاث طبقات. تحتوي الطبقة العليا على هياكل أصغر مثل الأنابيب ، والطبقة الوسطى عبارة عن خرز به كبيبات ، والطبقة السفلية تحتوي على حطام. يستنشق بعناية الطاف والطبقة البيضاء العليا.
بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات التي تحتوي على حبات تحمل الكبيبات والحطام في 1.5 ملليلتر من HBSS وانقلها إلى أنبوب سعة 2 ملليلتر. ضع الأنبوب في مكثف مغناطيسي واستنشق المادة الطافية قبل غسل الخرز مرتين باستخدام ملليلتر واحد من HBSS. ضع 20 ميكرولتر من معلق الخلية على شريحة.
ثم راقب الشريحة تحت المجهر لوجود الكبيبات. بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في وسط نمو الخلايا البطانية وانقل التعليق إلى أنبوب سعة 2 ملليلتر. أضف ميكرولترا واحدا من إنترفيرون جاما لكل ثلاثة ملليلتر من الوسط ، وضع الخلايا في صفيحة من ستة آبار للحضانة عند 33 درجة مئوية.
بعد ثلاثة أيام من الثقافة ، استبدل بعناية وسط ملليلتر واحد بوسط جديد. في هذه المرحلة ، تكون الخلايا غير متجانسة مع مزيج من الخلايا الكبيبية. بعد سبعة أيام ، استبدل الوسط بمليلين من وسط نمو الخلايا البطانية الطازجة ، مع استكماله بإنترفيرون جاما لبدء تكاثر الخلايا.
بعد 10 أيام ، عندما تصل الخلايا إلى 80٪ من الالتقاء ، قم بتمريرها باستخدام التربسين ونقلها إلى قارورة T-25 مغلفة بالكولاجين IV.بعد 21 يوما من الثقافة ، انقل الخلايا إلى قارورة T-75. أضف ثلاثة ملليلتر من 0.25٪ تربسين إلى دورق T-75 واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بتحييد التربسين بثلاثة ملليلتر من وسط النمو البطاني ونقل التعليق إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر للطرد المركزي عند 200 XG لمدة خمس دقائق.
نضح المادة الطافية وغسل الخلايا في ملليلتر واحد من PBS تحتوي على 1٪ BSA ، EDTA اثنين مليمولار ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. مرة أخرى ، قم بالطرد المركزي وإعادة تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من الخرز المطلي بالأجسام المضادة CD31 و 800 ميكرولتر من PBS. احتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة مع الاهتزاز المستمر عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد ذلك ، ضع الأنبوب في المكثف المغناطيسي واغسل الخلايا أربع مرات باستخدام PBS الذي يحتوي على BSA و EDTA والبنسلين / الستربتومايسين. بعد الغسيل الأخير ، أعد تعليق الخلايا في ثلاثة ملليلتر من وسط النمو البطاني ، مع استكمال إنترفيرون جاما. لوحة 1.5 ملليلتر من الخلايا لكل بئر في الآبار المغلفة بالكولاجين IV على لوحة من ستة آبار واستزراع في ظل ظروف متساهلة عند 33 درجة مئوية.
بعد أربعة أيام ، استبدل 750 ميكرولتر من الوسط بوسط نمو بطاني جديد ، مع استكمال إنترفيرون جاما. بعد 10 إلى 14 يوما من الثقافة ، باستخدام مجهر فوق الفلور مع مرشح 488 نانومتر ، راقب نمو الخلايا البطانية الكبيبية الإيجابية CD31 ، أو GECs ، المستعمرات التي تعبر عن الميتوكوندريا الفلورية. بعد 21 يوما ، أو عندما تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ من التقاء ، قم بنقلها إلى قارورة T-25.
حافظ على الثقافة باستخدام وسيط نمو RPMI يحتوي على 10٪ FCS. بدلا من ذلك ، يمكن حفظ الخلايا بالتبريد. خلايا المرور باستخدام التربسين ، كما هو موضح سابقا.
ثم, الطرد المركزي الخلايا وإعادة تعليق بيليه في ثلاثة ملليلتر من وسط التجميد. احصل على الخلايا في أنابيب التبريد وتخزينها في النيتروجين السائل ، درجة حرارة البخار. وصف هذا البروتوكول طريقة لعزل الخلايا البطانية الكبيبية.
من الكبيبات المعزولة ، بدأت الخلايا تنمو ببطء بعد ثلاثة أيام من الثقافة. بعد سبعة أيام ، بدت الخلايا غير متجانسة وأظهرت أنواعا أخرى من الخلايا الكبيبية ، مثل الخلايا البودية ، والخلايا الجدارية ، والظهارية ، والخلايا المتوسطة. بعد الوصول إلى 70 إلى 80٪ من الالتقاء ، تمت إزالة الخلايا الكبيبية الأخرى باستخدام مجموعة إيجابية من الخلايا البطانية.
عبرت MitoDendra2 GECs عن CD31 وكانت سلبية لعلامة podocyte ، كما هو موضح في تلطيخ synaptopodin السلبي. تم فحص تأثير تركيز الجلوكوز على بنية الميتوكوندريا. بالمقارنة مع الميتوكوندريا الممدودة المرئية في الخلايا تحت الجلوكوز الطبيعي ، فإن ارتفاع الجلوكوز الناجم عن تجزئة أو انشطار الميتوكوندريا ، كما لوحظ من قبل الميتوكوندريا البارزة على شكل كروي.
علاوة على ذلك ، تم استخدام ليزر 405 نانومتر لتحويل مجموعة فرعية مختارة من الميتوكوندريا في MitoDendra2 GEC حي واحد. يظهر تبديل ضوئي ناجح للميتوكوندريا من الأخضر إلى الأحمر في المنطقة المحددة للخلايا المعالجة بتركيز الجلوكوز الطبيعي والعالي. سمح هذا التبديل بمشاهدة أحداث الاندماج في MitoDendra2 GECs.
تحت الجلوكوز الطبيعي ، لوحظ مضان أصفر مدمج أخضر وأحمر بسبب اندماج مصفوفة الميتوكوندريا. في المقابل ، في GECs المعالجة بالجلوكوز العالي ، كانت الميتوكوندريا مجزأة بشكل أساسي. يعد وضع الخلايا في بئر واحد من صفيحة من ستة آبار ذات حجم صغير من وسط النمو أمرا ضروريا للسماح للخلايا بالالتصاق بالطبق.
يمكن استخدام الخلايا البطانية المعزولة لأداء وظيفة الميتوكوندريا والدراسات الهيكلية. إن استخدام الخلايا البطانية الخالدة مع ميزات الميتوكوندريا الفلورية سيمهد الطريق نحو اكتشاف الأدوية. يمكن اختبار الجزيئات الصغيرة على الخلايا ، ويتم إجراء التصوير الحي لفحص تأثيرها على وظيفة الميتوكوندريا.
