受精卵显微注射用于在小鼠中产生基因盒敲入和絮状等位基因

我们的实验方案有助于创建需要高级小鼠体内实验的转基因小鼠，例如基因表达可视化、遗传人源化和条件基因敲除。这里介绍的小鼠受精卵基因组编辑技术能够高效、快速和简单地诱导先进的基因修饰，例如基因盒敲入和 flox。由于转基因小鼠用于神经病学、免疫学、代谢、生殖和传染病等多种研究领域，因此我们在这里介绍的技术从根本上支持了这一广泛的研究领域。

演示该程序的将是我实验室的技术人员夏美壹岐、石田美雪和谷本洋子。首先，准备两个用于受精卵培养的35毫米培养皿，并将它们置于37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中直至使用。收集输卵管并将它们放入培养皿盖上含有每毫升透明质酸酶0.75毫克的20微升M2培养基中。

使用细头镊子拾取一个输卵管，并通过菌毛将约 50 微升的 M2 培养基与透明质酸酶灌注。30秒后，使用玻璃毛细管，用少量培养基拾取形态正常的受精卵，并通过将它们转移到新鲜的M16中滴中来洗涤它们。然后，将洗过的受精卵汇集到培养皿中并重复该过程，直到取回所有受精卵。

使用可编程移液器拉拔器，拉动一些玻璃移液器。通过撞击连接到微锻尖端的玻璃球来打破显微注射针的尖端。在显微镜下以1， 000倍放大倍率检查尖端尺寸，并确保显微注射针的尖端尺寸直径约为一微米。

使用微锻件在距离尖端约两到三毫米处弯曲显微注射针。将 1 至 1.5 厘米的操作液体注入显微注射针的中心，并使用压电陶瓷促动器将其连接到手动微量注射器支架上。接下来，将保持针连接到对面的手动微量注射器支架上，并以逐渐的压力将操作液移动到显微注射针尖。

将手动显微注射器支架固定在显微操纵器上。准备一个带有三个液滴的注射室。首先，用10微升M2培养基，第二，用5微升12%聚乙烯吡咯烷酮在M2培养基中，第三，用5微升crRNA，tracrRNA，Cas9蛋白和供体DNA溶液的混合物。

用矿物油覆盖液滴，并将注射室放在倒置显微镜载物台上。在倒置显微镜下，以50倍放大倍率，将显微注射移液管降低到12%PVP液滴中。吸出并分配 12% PVP 以清洁显微注射针尖的内部并将其转移到 RNPD 液滴中。

将手动显微注射器置于负压下。将RNPD溶液吸入显微注射针中，等待直到吸出足够的体积。在50倍放大镜下，用液体填充显微注射针的整个内部。

然后，停止进气，通过将手动显微注射器设置为正压，逐渐排出RNPD溶液。将显微注射针的尖端移动到油中。将50个受精卵放入M2液滴中，并轻轻地将保持移液管降低到同一液滴中。

将显微注射针转移到含有受精卵的M2液滴上。切换到20倍物镜，并聚焦在显微注射移液器的尖端。握住受精卵后，通过移动显微操纵器专注于原核。

将显微注射针插入受精卵，并将尖端靠近原核。一旦尖端到达原核膜，施加压电脉冲刺穿。当显微注射针刺穿原核时，注射RNPD溶液并观察原核的肿胀。

一旦原核完全充气，迅速拔出针头并对雌性和雄性原核执行相同的程序。通过将注射的受精卵移动到M2液滴内的另一个位置来区分注射前后的受精卵，并继续注射M2液滴中存在的所有受精卵。注射后，将受精卵转移到新鲜的M16培养皿中。

注射后10分钟选择存活的受精卵。去除被注射损坏的裂解受精卵，并将存活的受精卵分配到M16培养皿中的每个液滴中。放置少量培养基，一些气泡作为标记，并将受精卵放入移液管中进行转移。

使用微型剪切机，在壶腹和输卵管的胳膓之间做一个切口。将受精卵引入切口，同时确认已引入气泡。13只独立基因盒敲入小鼠的中位生产效率为20.8%，最高为39.5%，最低为7.9%，在该非致死性基因靶向条件下的中位出生率为34.0%，最高为43.3%，最小为15.9%10只独立絮状小鼠的中位生产效率为7.7%，最高为20.7%，最小为2.1%，尽管几个靶基因的功能是未知，中位出生率为30.2%，最高为43.8%，最小为17.3%，注射针尖直径不宜太细，应调整手动注射器压力，保证注射针内溶液，原核缓慢充气。