Protokollerimiz, gen ekspresyonunun görselleştirilmesi, genetik insancıllaştırma ve koşullu gen nakavtı gibi gelişmiş fare in vivo deneyleri gerektiren genetiği değiştirilmiş farelerin oluşturulmasına yardımcı olur. Burada sunulan fare zigot genom düzenleme tekniği, gen kaseti knock-in ve flox gibi gelişmiş genetik modifikasyonların son derece verimli, hızlı ve basit bir şekilde indüklenmesini sağlar. Genetiği değiştirilmiş fareler nöroloji, immünoloji, metabolizma, üreme ve bulaşıcı hastalıklar gibi çeşitli araştırma alanlarında kullanıldığından, burada sunulan teknolojimiz bu geniş araştırma alanını temel olarak desteklemektedir.
Prosedürü gösterenler, laboratuvarımdan teknik personel Natsumi Iki, Miyuki Ishida ve Yoko Tanimoto olacak. Başlamak için, zigot kültürü için iki adet 35 milimetrelik Petri kabı hazırlayın ve bunları kullanıma kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübatöre yerleştirin. Yumurtalıkları toplayın ve Petri kabının kapağında mililitre başına 0.75 miligram hyaluronidaz içeren 20 mikrolitrelik M2 ortamına yerleştirin.
Bir yumurta kanalını almak için ince uçlu bir forseps kullanın ve fimbrialardan hyaluronidaz ile yaklaşık 50 mikrolitre M2 ortamını perfüze edin. 30 saniye sonra, bir cam kılcal damar kullanarak, morfolojik olarak normal zigotları az miktarda orta miktarda ile toplayın ve taze M16 orta damlacıklarına aktararak yıkayın. Ardından, yıkanmış zigotları bir Petri kabına koyun ve tüm zigotlar alınana kadar işlemi tekrarlayın.
Programlanabilir pipet çektiriciyi kullanarak bazı cam pipetleri çekin. Microforge ucuna takılı cam topa vurarak mikroenjeksiyon iğnesinin ucunu kırın. Uç boyutunu mikroskop altında 1.000x büyütmede kontrol edin ve mikroenjeksiyon iğnesinin uç boyutunun yaklaşık bir mikrometre çapında olduğundan emin olun.
Mikroenjeksiyon iğnesini uçtan yaklaşık iki ila üç milimetre bükmek için bir mikroforge kullanın. İşlem sıvısının 1 ila 1,5 santimetresini mikroenjeksiyon iğnesinin ortasına enjekte edin ve piezo aktüatörü ile manuel mikroenjektör tutucusuna takın. Daha sonra, tutma iğnesini karşı manuel mikroenjektör tutucusuna takın ve işlem sıvısını kademeli basınçla mikroenjeksiyon iğne ucuna taşıyın.
Manuel mikroenjektör tutucularını mikromanipülatöre sabitleyin. Üç damlacık içeren bir enjeksiyon odası hazırlayın. Birincisi, 10 mikrolitre M2 ortamıyla, ikincisi, M2 ortamında beş mikrolitre% 12 polivinilpirolidon ile ve üçüncüsü, beş mikrolitre crRNA, tracrRNA, Cas9 proteini ve donör DNA çözeltisi karışımı ile.
Damlacıkları mineral yağ ile örtün ve enjeksiyon odasını ters mikroskop aşamasına yerleştirin. 50x büyütmede ters çevrilmiş mikroskop altında, mikroenjeksiyon pipetini %12 PVP damlasına indirin. Mikroenjeksiyon iğne ucunun içini temizlemek ve RNPD damlacığına aktarmak için% 12 PVP'yi aspire edin ve dağıtın.
Manuel mikroenjektörü negatif basınç altına alın. RNPD solüsyonunu mikroenjeksiyon iğnesine emin ve yeterli bir hacim aspire edilene kadar bekleyin. 50x büyütme altında, mikroenjeksiyon iğnesinin içini sıvı ile doldurun.
Ardından, girişi durdurun ve manuel mikroenjektörünü pozitif basınca ayarlayarak RNPD çözeltisinin kademeli olarak dışarı atılmasına izin verin. Mikroenjeksiyon iğnesinin ucunu yağın içine doğru hareket ettirin. M2 damlacığına 50 zigot koyun ve tutma pipetini yavaşça aynı damlacığa indirin.
Mikroenjeksiyon iğnesini zigot içeren M2 damlasına aktarın. 20x hedefine geçin ve mikroenjeksiyon pipetinin ucuna odaklanın. Bir zigot tuttuktan sonra, mikromanipülatörü hareket ettirerek proçekirdeğe odaklanın.
Mikroenjeksiyon iğnesini zigotun içine yerleştirin ve ucu proçekirdeğe yaklaştırın. Uç pronükleus membranına ulaştığında, delmek için piezo darbesini uygulayın. Mikroenjeksiyon iğnesi proçekirdeği deldiğinde, RNPD çözeltisini enjekte edin ve proçekirdeğin şişmesini gözlemleyin.
Pronükleus tamamen şişirildikten sonra, iğneyi hızla çıkarın ve aynı prosedürü hem dişi hem de erkek pronüklei üzerinde uygulayın. Enjekte edilen zigotu M2 damlacığı içinde başka bir yere taşıyarak enjeksiyondan önce ve sonra zigotları ayırt edin ve M2 damlacığında bulunan tüm zigotları enjekte etmeye devam edin. Enjeksiyondan sonra, zigotları taze bir M16 kabına aktarın.
Enjeksiyondan 10 dakika sonra hayatta kalan zigotları seçin. Enjeksiyondan zarar gören lize zigotları çıkarın ve hayatta kalan zigotları M16 kabındaki her damlacığa dağıtın. Az miktarda kültür ortamı, işaretleyici olarak bazı hava kabarcıkları ve transfer için zigotları bir pipete yerleştirin.
Bir mikro makas kullanarak, ampulla ile yumurta kanalının fimbriaları arasında bir kesi yapın. Zigotları insizyona sokun ve aynı anda hava kabarcığının sokulduğunu onaylayın. 13 bağımsız gen kaset knock-in faresinin medyan üretim verimliliği maksimum% 39.5 ve minimum% 7.9 ile% 20.8 idi Bu ölümcül olmayan gen hedefleme koşulu altında medyan doğum oranı% 34.0 idi maksimum% 43.3 ve minimum% 15.9 10 bağımsız floksed farenin medyan üretim verimliliği% 7.7 idi maksimum% 20.7 ve minimum% 2.1 Birkaç hedef genin fonksiyonları olmasına rağmen. Bilinmiyor, medyan doğum oranı maksimum% 43.8 ve minimum% 17.3 ile% 30.2 idiEnjeksiyon iğnesinin uç çapı çok ince olmamalı ve iğnedeki çözeltinin enjekte edilmesini ve proçekirdeğin yavaşça şişirilmesini sağlamak için manuel enjektörün basıncı ayarlanmalıdır.
