私たちのプロトコルは、遺伝子発現の視覚化、遺伝子ヒト化、条件付き遺伝子ノックアウトなど、高度なマウスin vivo実験を必要とする遺伝子改変マウスの作成に役立ちます。ここで紹介するマウス接合子ゲノム編集技術は、遺伝子カセットノックインやフロックスなどの高度な遺伝子改変を高効率、迅速、かつ簡単に誘導することができます。遺伝子改変マウスは、神経内科学、免疫学、代謝学、生殖学、感染症学など多様な研究分野で利用されているため、ここで紹介する技術は、この幅広い研究分野を根本的に支えるものです。
手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術スタッフである壱岐夏美、石田美幸、谷本洋子です。はじめに、接合子培養用の35ミリメートルペトリ皿を2枚用意し、使用するまで摂氏37度と二酸化炭素5%のインキュベーターに入れます。卵管を収集し、ペトリ皿の蓋に1ミリリットルあたり0.75ミリグラムのヒアルロニダーゼを含む20マイクロリットルのM2培地に入れます。
細い先端鉗子を使用して1つの卵管を拾い上げ、約50マイクロリットルのM2培地をヒアルロニダーゼとともにフィンブリエに灌流します。30秒後、ガラスキャピラリーを使用して、形態学的に正常な接合子を少量の培地でピックアップし、新鮮なM16培地液滴に移して洗浄します。次に、洗浄した接合子をペトリ皿にプールし、すべての接合子が回収されるまでこのプロセスを繰り返します。
プログラム可能なピペットプーラーを使用して、ガラスピペットをいくつか引き出します。マイクロフォージ先端に付いているガラス玉を叩いてマイクロ注入針の先端を折る。顕微鏡でチップサイズを1、000倍の倍率で確認し、マイクロインジェクションニードルのチップサイズが直径約1マイクロメートルであることを確認します。
マイクロフォージを使用して、先端から約2〜3ミリメートルでマイクロインジェクションニードルを曲げます。マイクロインジェクションニードルの中央に1〜1.5センチの操作液を注入し、ピエゾアクチュエータで手動マイクロインジェクターホルダーに取り付けます。次に、保持針を反対側の手動マイクロインジェクターホルダーに取り付け、操作液を徐々に圧力をかけながらマイクロインジェクション針先に移動させます。
手動マイクロインジェクターホルダーをマイクロマニピュレーターに固定します。3液滴の注入室を用意します。第1に、10マイクロリットルのM2培地、第2に、M2培地中の5マイクロリットルの12%ポリビニルピロリドン、第3に、crRNA、tracrRNA、Cas9タンパク質、およびドナーDNA溶液の5マイクロリットル混合物を用いた。
液滴を鉱物油で覆い、注入チャンバーを倒立顕微鏡ステージにセットします。倒立顕微鏡で50倍の倍率で、マイクロインジェクションピペットを12%PVPドロップに下げます。12%PVPを吸引して分注し、マイクロインジェクションニードルチップの内側を洗浄し、RNPD液滴に移します。
手動マイクロインジェクターを負圧下に置きます。RNPD溶液をマイクロインジェクションニードルに吸い込み、十分な容量が吸引されるまで待ちます。倍率50倍以下で、マイクロインジェクションニードルの内側全体を液体で満たします。
次に、吸気を停止し、手動マイクロインジェクターを陽圧に設定してRNPD溶液を徐々に排出できるようにします。マイクロインジェクションニードルの先端をオイルに動かします。M2液滴に50個の接合子を入れ、保持ピペットを同じ液滴に静かに下げます。
マイクロインジェクションニードルを接合子を含むM2ドロップに移します。20倍の対物レンズに切り替えて、マイクロインジェクションピペットの先端に焦点を合わせます。接合子を保持した後、マイクロマニピュレーターを動かして前核に焦点を合わせます。
マイクロインジェクションニードルを接合子に挿入し、先端を前核に近づけます。先端が前核膜に到達したら、ピエゾパルスを印加して穴を開けます。マイクロインジェクション針が前核に穿刺したら、RNPD溶液を注入し、前核の腫れを観察します。
前核が完全に膨らんだら、すぐに針を引き出し、女性と男性の両方の前核で同じ手順を実行します。注入された接合子をM2液滴内の別の場所に移動させることによって注入前後の接合子を区別し、M2液滴に存在するすべての接合子を注入し続ける。注射後、接合子を新鮮なM16皿に移します。
注射の10分後に生き残った接合子を選択します。注射によって損傷した溶解した接合子を取り除き、生き残った接合子をM16ディッシュの各液滴に分配します。少量の培地、マーカーとして気泡を入れ、接合子をピペットに入れて移します。
マイクロせん断を使用して、膨大部と卵管の線毛の間を切開します。接合子を切開部に導入し、同時に気泡が導入されたことを確認します。13匹の独立した遺伝子カセットノックインマウスの生産効率の中央値は20.8%で最大39.5%、最小7.9%でしたこの非致死性遺伝子標的条件下での出生率の中央値は34.0%で最大43.3%と最小15.9%でした10匹の独立したフロックスマウスの生産効率の中央値は7.7%で最大20.7%、最小2.1%でしたが、いくつかの標的遺伝子の機能は不明、出生率の中央値は30.2%で、最大43.8%、最小17.3%注射針の先端直径は細すぎず、手動注射器の圧力を調整して、針内の溶液が注入され、前核がゆっくりと膨張するようにする必要があります。
