Nossos protocolos ajudam a criar camundongos geneticamente modificados que exigem experimentos avançados em camundongos in vivo, como visualização da expressão gênica, humanização genética e nocaute condicional de genes. A técnica de edição do genoma do zigoto de camundongo apresentada aqui permite a indução altamente eficiente, rápida e simples de modificações genéticas avançadas, como o knock-in e o flox do genético. Uma vez que camundongos geneticamente modificados são usados em diversos campos de pesquisa, como neurologia, imunologia, metabolismo, reprodução e doenças infecciosas, nossa tecnologia apresentada aqui é fundamentalmente de apoio a esse amplo campo de pesquisa.
Quem demonstrará o procedimento será Natsumi Iki, Miyuki Ishida e Yoko Tanimoto, equipe técnica do meu laboratório. Para começar, prepare duas placas de Petri de 35 milímetros para a cultura do zigoto e coloque-as na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até o uso. Recolher os ovidutos e colocá-los em gota de 20 microlitros de meio M2 contendo 0,75 miligramas por mililitro de hialuronidase na tampa da placa de Petri.
Use uma pinça de ponta fina para pegar um oviduto e perfundir cerca de 50 microlitros de meio M2 com hialuronidase através das fímbrias. Após 30 segundos, usando um capilar de vidro, pegue zigotos morfologicamente normais com uma pequena quantidade de meio e lave-os transferindo-os para gotículas médias M16 frescas. Em seguida, junte os zigotos lavados em uma placa de Petri e repita o processo até que todos os zigotos sejam recuperados.
Usando o puxador de pipeta programável, puxe algumas pipetas de vidro. Quebre a ponta da agulha de microinjeção batendo na bola de vidro presa à ponta da microforja. Verifique o tamanho da ponta em um microscópio com aumento de 1.000x e certifique-se de que o tamanho da ponta da agulha de microinjeção tenha cerca de um micrômetro de diâmetro.
Use uma microforja para dobrar a agulha de microinjeção a cerca de dois a três milímetros da ponta. Injete de 1 a 1,5 centímetros do líquido de operação no centro da agulha de microinjeção e conecte-o ao suporte manual do microinjetor com o atuador piezo. Em seguida, conecte a agulha de fixação ao suporte manual oposto do microinjetor e mova o líquido de operação para a ponta da agulha de microinjeção com pressão gradual.
Fixe os suportes manuais do microinjetor no micromanipulador. Prepare uma câmara de injeção com três gotículas. Primeiro, com 10 microlitros de meio M2, segundo, com cinco microlitros de polivinilpirrolidona a 12% em meio M2, e terceiro, com mistura de cinco microlitros de crRNA, tracrRNA, proteína Cas9 e solução de DNA do doador.
Cubra as gotículas com óleo mineral e coloque a câmara de injeção no estágio do microscópio invertido. Sob o microscópio invertido em um aumento de 50x, abaixe a pipeta de microinjeção para a gota de PVP de 12%. Aspirar e dispensar PVP a 12% para limpar o interior da ponta da agulha de microinjeção e transferi-lo para a gota RNPD.
Coloque o microinjetor manual sob pressão negativa. Sugar a solução de RNPD na agulha de microinjeção e esperar até que um volume suficiente seja aspirado. Sob aumento de 50x, preencha todo o interior da agulha de microinjeção com líquido.
Em seguida, pare a ingestão e deixe a solução RNPD ser expelida gradualmente, ajustando o microinjetor manual para pressão positiva. Mova a ponta da agulha de microinjeção para dentro do óleo. Coloque 50 zigotos na gota M2 e abaixe suavemente a pipeta de retenção na mesma gota.
Transfira a agulha de microinjeção para a gota M2 contendo zigotos. Mude para uma objetiva de 20x e concentre-se na ponta da pipeta de microinjeção. Depois de segurar um zigoto, concentre-se no pró-núcleo movendo o micromanipulador.
Insira a agulha de microinjeção no zigoto e aproxime a ponta do pró-núcleo. Uma vez que a ponta atinge a membrana do pró-núcleo, aplique o pulso piezo para perfurar. Quando a agulha de microinjeção punciona o pró-núcleo, injete a solução de RNPD e observe o inchaço do pró-núcleo.
Uma vez que o pró-núcleo esteja totalmente inflado, puxe rapidamente a agulha e realize o mesmo procedimento nos pró-núcleos feminino e masculino. Diferenciar os zigotos antes e depois da injeção, movendo o zigoto injetado para outro local dentro da gota M2, e continuar injetando todos os zigotos presentes na gota M2. Após a injeção, transfira os zigotos para um prato M16 fresco.
Selecione os zigotos sobreviventes 10 minutos após a injeção. Remova os zigotos lisados danificados pela injeção e distribua os zigotos sobreviventes para cada gotícula na placa M16. Coloque uma pequena quantidade de meio de cultura, algumas bolhas de ar como marcador e os zigotos em uma pipeta para transferência.
Usando um micro cisalhamento, faça uma incisão entre a ampola e as fímbrias do oviduto. Introduzir os zigotos na incisão e, simultaneamente, confirmar que a bolha de ar foi introduzida. A eficiência mediana de produção de 13 camundongos independentes knock-in de genético foi de 20,8% com um máximo de 39,5% e um mínimo de 7,9%A taxa mediana de nascimento sob esta condição de alvo de gene não letal foi de 34,0% com um máximo de 43,3% e um mínimo de 15,9%A eficiência mediana de produção dos 10 camundongos independentes floxados foi de 7,7% com um máximo de 20,7% e um mínimo de 2,1%. desconhecido, a taxa mediana de natalidade foi de 30,2%, com um máximo de 43,8% e um mínimo de 17,3%O diâmetro da ponta da agulha de injeção não deve ser muito fino e a pressão do injetor manual deve ser ajustada para garantir que a solução na agulha seja injetada e que o pró-núcleo seja lentamente inflado.
