당사의 프로토콜은 유전자 발현 시각화, 유전적 인간화 및 조건부 유전자 녹아웃과 같은 고급 마우스 생체 내 실험이 필요한 유전자 변형 마우스를 만드는 데 도움이 됩니다. 여기에 제시된 마우스 접합체 게놈 편집 기술은 유전자 카세트 knock-in 및 flox와 같은 고급 유전자 변형의 매우 효율적이고 신속하며 간단한 유도를 가능하게 합니다. 유전자 변형 마우스는 신경학, 면역학, 대사, 생식, 감염성 질환 등 다양한 연구 분야에서 활용되고 있기 때문에 여기에 제시된 기술은 이러한 광범위한 연구 분야를 근본적으로 뒷받침하고 있습니다.
절차를 시연하는 것은 이키 나츠미, 이시다 미유키, 타니모토 요코, 내 연구실의 기술 직원입니다. 시작하려면 접합체 배양을 위해 35mm 페트리 접시 2개를 준비하고 사용할 때까지 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 넣습니다. 난관을 모아 페트리 접시 뚜껑에 히알루로니다제 밀리리터당 0.75mg을 함유한 M20 배지 20마이크로리터 방울에 넣습니다.
미세한 팁 집게를 사용하여 하나의 난관을 집어 들고 약 50 마이크로 리터의 M2 배지를 히알루로니다아제와 함께 fimbriae를 통해 관류합니다. 30 초 후, 유리 모세관을 사용하여 소량의 배지로 형태 학적으로 정상적인 접합체를 집어 들고 신선한 M16 배지 방울로 옮겨 세척합니다. 그런 다음 세척된 접합체를 페트리 접시에 모으고 모든 접합체가 회수될 때까지 이 과정을 반복합니다.
프로그래밍 가능한 피펫 풀러를 사용하여 유리 피펫을 당깁니다. 마이크로 포지 팁에 부착 된 유리 볼을 쳐서 미세 주입 바늘의 끝을 부러 뜨립니다. 현미경으로 팁 크기를 1, 000x 배율로 확인하고 미세 주입 바늘의 팁 크기가 직경이 약 1마이크로미터인지 확인합니다.
마이크로 포지를 사용하여 미세 주입 바늘을 팁에서 약 2-3 밀리미터로 구부립니다. 1 내지 1.5 센티미터의 작동액을 미세주입 바늘의 중앙에 주입하고 피에조 액추에이터와 수동 마이크로인젝터 홀더에 부착한다. 그런 다음 고정 바늘을 반대쪽 수동 미세 주입기 홀더에 부착하고 점진적인 압력으로 작동 액체를 미세 주입 바늘 끝으로 이동합니다.
마이크로 매니퓰레이터에 수동 마이크로 인젝터 홀더를 고정합니다. 3 개의 물방울로 주입 챔버를 준비하십시오. 첫째, 10마이크로리터의 M2 배지, 둘째, M2 배지에 5마이크로리터의 12% 폴리비닐피롤리돈, 셋째, crRNA, tracrRNA, Cas9 단백질 및 기증자 DNA 용액의 혼합물 5마이크로리터를 사용합니다.
물방울을 미네랄 오일로 덮고 주입 챔버를 도립 현미경 스테이지에 놓습니다. 50x 배율의 도립 현미경에서 미세 주입 피펫을 12% PVP 방울로 내립니다. 12%PVP를 흡인 및 분주하여 미세주입 바늘 끝 내부를 청소하고 RNPD 방울로 옮깁니다.
수동 마이크로 인젝터를 음압에 두십시오. RNPD 용액을 미세주입 바늘로 빨아들이고 충분한 부피가 흡인될 때까지 기다립니다. 50x 배율 이하에서 미세 주입 바늘 내부 전체를 액체로 채 웁니다.
그런 다음 흡입을 중단하고 수동 미세 주입기를 양압으로 설정하여 RNPD 용액이 서서히 배출되도록 합니다. 미세 주입 바늘의 끝을 오일로 옮깁니다. M2 방울에 접합체 50개를 넣고 홀딩 피펫을 같은 방울로 부드럽게 내립니다.
접합체가 포함된 M2 방울에 미세주입 바늘을 옮깁니다. 20x 대물렌즈로 전환하고 미세주입 파이펫의 팁에 초점을 맞춥니다. 접합체를 잡은 후 미세 조작기를 움직여 전핵에 초점을 맞춥니다.
미세 주입 바늘을 접합체에 삽입하고 팁을 전핵에 가깝게 가져옵니다. 팁이 전핵막에 도달하면 피에조 펄스를 적용하여 피어싱합니다. 미세주사바늘이 전핵에 구멍을 뚫으면 RNPD 용액을 주입하여 전핵의 부종을 관찰한다.
전핵이 완전히 부풀어 오르면 신속하게 바늘을 빼내고 암컷과 수컷 전핵 모두에 동일한 절차를 수행합니다. 주입된 접합체를 M2 액적 내의 다른 위치로 이동시켜 주입 전후의 접합체를 구별하고 M2 액적에 존재하는 모든 접합체를 계속 주입합니다. 주사 후 접합체를 신선한 M16 접시에 옮깁니다.
주사 후 10 분 후에 생존 한 접합체를 선택하십시오. 주입에 의해 손상된 용해된 접합체를 제거하고 살아남은 접합체를 M16 접시의 각 방울에 분배합니다. 소량의 배양 배지, 약간의 기포를 마커로 배치하고 접합체를 피펫에 넣어 이식합니다.
미세 전단기를 사용하여 팽대부와 난관의 섬유질 사이를 절개합니다. 접합체를 절개 부위에 도입하고 동시에 기포가 도입되었는지 확인합니다. 13 개의 독립적 인 유전자 카세트 녹인 마우스의 평균 생산 효율은 20.8 %로 최대 39.5 %와 최소 7.9 %이 치명적이지 않은 유전자 표적 조건 하에서 평균 출생률은 34.0 %로 최대 43.3 %와 최소 15.9 %10 개의 독립적 인 플록스 마우스의 평균 생산 효율은 7.7 %로 최대 20.7 %와 최소 2.1 %였습니다. 알 수 없음, 평균 출생률은 30.2 %최대 43.8 %및 최소 17.3 %주사 바늘의 끝 직경이 너무 얇아서는 안되며, 수동 주사기의 압력을 조정하여 바늘의 용액이 주입되고 전핵이 천천히 팽창되도록해야합니다.
