Nos protocoles aident à créer des souris génétiquement modifiées qui nécessitent des expériences in vivo avancées sur des souris, telles que la visualisation de l’expression génique, l’humanisation génétique et l’élimination conditionnelle des gènes. La technique d’édition du génome du zygote de souris présentée ici permet l’induction très efficace, rapide et simple de modifications génétiques avancées, telles que le knock-in de cassette génétique et le flox. Étant donné que les souris génétiquement modifiées sont utilisées dans divers domaines de recherche tels que la neurologie, l’immunologie, le métabolisme, la reproduction et les maladies infectieuses, notre technologie présentée ici soutient fondamentalement ce vaste domaine de recherche.
Natsumi Iki, Miyuki Ishida et Yoko Tanimoto, membres du personnel technique de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, préparez deux boîtes de Petri de 35 millimètres pour la culture du zygote et placez-les dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’à utilisation. Recueillir les oviductes et les placer dans une goutte de 20 microlitres de milieu M2 contenant 0,75 milligramme par millilitre de hyaluronidase sur le couvercle de la boîte de Pétri.
Utilisez une pince à pointe fine pour ramasser un oviducte et perfuser environ 50 microlitres de milieu M2 avec de la hyaluronidase à travers les fimbriae. Après 30 secondes, à l’aide d’un capillaire en verre, ramasser les zygotes morphologiquement normaux avec une petite quantité de milieu et les laver en les transférant dans des gouttelettes moyennes fraîches de M16. Ensuite, mettez les zygotes lavés dans une boîte de Petri et répétez le processus jusqu’à ce que tous les zygotes soient récupérés.
À l’aide de l’extracteur de pipette programmable, tirez des pipettes en verre. Cassez la pointe de l’aiguille de micro-injection en frappant la bille de verre attachée à la pointe de la microforge. Vérifiez la taille de la pointe au microscope à un grossissement de 1 000x et assurez-vous que la taille de la pointe de l’aiguille de micro-injection est d’environ un micromètre de diamètre.
Utilisez une microforge pour plier l’aiguille de micro-injection à environ deux à trois millimètres de la pointe. Injectez 1 à 1,5 centimètre du liquide opératoire au centre de l’aiguille de micro-injection et fixez-le au support du micro-injecteur manuel avec l’actionneur piézoélectrique. Ensuite, fixez l’aiguille de maintien au porte-micro-injecteur manuel opposé et déplacez le liquide d’opération vers l’extrémité de l’aiguille de micro-injection avec une pression progressive.
Fixez les supports de micro-injecteur manuels sur le micromanipulateur. Préparez une chambre d’injection avec trois gouttelettes. Premièrement, avec 10 microlitres de milieu M2, deuxièmement, avec cinq microlitres de polyvinylpyrrolidone à 12% en milieu M2, et troisièmement, avec cinq microlitres de mélange d’ARNcr, d’ARNcr, de protéine Cas9 et de solution d’ADN donneur.
Couvrir les gouttelettes d’huile minérale et placer la chambre d’injection sur la platine du microscope inversé. Sous le microscope inversé à un grossissement de 50x, abaissez la pipette de micro-injection dans la goutte PVP de 12%. Aspirer et distribuer 12% de PVP pour nettoyer l’intérieur de la pointe de l’aiguille de micro-injection et le transférer dans la gouttelette RNPD.
Mettez le micro-injecteur manuel sous pression négative. Aspirer la solution de RNPD dans l’aiguille de micro-injection et attendre qu’un volume suffisant soit aspiré. Sous un grossissement de 50x, remplissez tout l’intérieur de l’aiguille de micro-injection avec du liquide.
Ensuite, arrêtez la prise et laissez la solution RNPD être expulsée progressivement en réglant le micro-injecteur manuel à pression positive. Déplacez la pointe de l’aiguille de micro-injection dans l’huile. Mettez 50 zygotes dans la gouttelette M2 et abaissez doucement la pipette de maintien dans la même gouttelette.
Transférer l’aiguille de micro-injection dans la goutte M2 contenant des zygotes. Passez à un objectif 20x et concentrez-vous sur la pointe de la pipette de micro-injection. Après avoir tenu un zygote, concentrez-vous sur le pronucleus en déplaçant le micromanipulateur.
Insérez l’aiguille de micro-injection dans le zygote et rapprochez l’embout du pronucleus. Une fois que la pointe atteint la membrane pronucleaire, appliquez l’impulsion piézoélectrique pour percer. Lorsque l’aiguille de micro-injection perce le pronucleus, injectez la solution RNPD et observez le gonflement du pronucleus.
Une fois que le pronucleus est complètement gonflé, retirez rapidement l’aiguille et effectuez la même procédure sur les pronuclei femelle et mâle. Différencier les zygotes avant et après l’injection en déplaçant le zygote injecté vers un autre endroit dans la gouttelette M2, et continuer à injecter tous les zygotes présents dans la gouttelette M2. Après l’injection, transférer les zygotes dans un plat frais de M16.
Sélectionnez les zygotes survivants 10 minutes après l’injection. Retirer les zygotes lysés endommagés par l’injection et distribuer les zygotes survivants à chaque gouttelette de la boîte M16. Placez une petite quantité de milieu de culture, quelques bulles d’air comme marqueur et les zygotes dans une pipette pour le transfert.
À l’aide d’un micro-cisaillement, faites une incision entre l’ampoule et les fimbriae de l’oviducte. Introduisez les zygotes dans l’incision et confirmez simultanément que la bulle d’air a été introduite. L’efficacité médiane de production de 13 souris knock-in à cassettes de gènes indépendantes était de 20,8% avec un maximum de 39,5% et un minimum de 7,9%Le taux de natalité médian dans cette condition de ciblage génétique non létal était de 34,0% avec un maximum de 43,3% et un minimum de 15,9%L’efficacité de production médiane des 10 souris indépendantes floxed était de 7,7% avec un maximum de 20,7% et un minimum de 2,1%Bien que les fonctions de plusieurs gènes cibles aient été inconnu, le taux de natalité médian était de 30,2% avec un maximum de 43,8% et un minimum de 17,3%Le diamètre de la pointe de l’aiguille d’injection ne doit pas être trop mince et la pression de l’injecteur manuel doit être ajustée pour s’assurer que la solution dans l’aiguille est injectée et que le pronucleus est lentement gonflé.
