该协议允许从复杂的生物样品（如细胞或组织脱盐）中对内源性CK2基质进行特定标记和随后的浓缩和鉴定。此方法可应用于任何细胞类型或组织。从而促进各种生物学背景下的CK2研究。
演示这个程序的将是约翰·乔伊诺夫斯基，一个研究生，从我的实验室。首先，机械地对组织样本或培养细胞进行培养，如文本协议中所述，总共收集 900 微升样品。在17，500倍重力下离心，在4摄氏度下离心3分钟。
然后，将270微升的上流液转移到三个新的1.7毫升微离心管中。取出 40 微升的剩余上一升用作输入控制，并将其传输到新管。将所有样品放在冰上。
首先，标记三个样品管，如下所示。在激酶反应管上，加入2.7微升的CK2和2.7微升的2.5毫摩尔GPGAmmaS。轻拂管子混合，并立即放在冰上。
在GPGAmmaS仅管，添加2.7微升2.5毫摩尔GPGAmmaS，和2.7微升的Lysis缓冲液。轻拂这个管子混合，并立即把它放在冰上。到PNBM仅管添加5.4微升的透析缓冲液。
轻拂管子混合，并立即放在冰上。在30摄氏度的水浴中孵育所有三个管子一分钟。在此之后，以每毫升12毫克的速度加入13.5微升的PNBM。
反转管子混合样品，在室温下孵育样品一小时。当样本孵育时，标记要加载样本的每个列，如下所示。通过多次反转每列来准备列，以重新在存储缓冲区中重新填充 Sephadex G-25 树脂。
将每一柱连接到夹紧支架上，让其不受干扰地坐约五分钟，让树脂沉淀。接下来，在每个柱的底部开口下方放置一个管。从每列的顶部和底部拆下盖，使存储缓冲液通过重力排入管中。
存储缓冲区耗尽后，向每列添加大约 2.7 毫升的 Lysis 缓冲区，以平衡它们，确保收集和丢弃流。重复此过程添加 Lysis 缓冲区并丢弃流通过三次。首先，将每个样本加载到各自的列中。
收集并丢弃流。将 420 微升的 Lysis 缓冲液添加到每列中，以清洗样品。让 Lysis 缓冲区通过列进行筛选，并收集和丢弃流通过。
然后，将管放在每个列下的位置以进行样品收集。将 500 微升的 Lysis 缓冲液添加到每列中，以对样品进行采样。收集流经，现在含有丰富的硫磷和alkylat CK2基质在激酶反应。
GTPgammaS 仅反应将包含硫磷化基质，由任何内源 CK2 存在。PNMB唯一反应将包含背景alkylat蛋白。作为"洗脱输入控制"样品，从每个洗脱中去除 80 微升。
接下来，将每个样品分成两个管，每个管包含 200 微升。将每个管标为抗硫磷酸盐酯或免疫球蛋白 G，如下所示。在每个抗硫磷酯管中加入2.8微克的抗硫磷酯抗体。
在每个 IGG 管中加入 2.8 微克异型控制抗体。然后将管子放在四摄氏度的旋转器上两个小时。在样品孵育的最后15分钟，使用干净的剃须刀刀片切断P200移液器尖端的末端，以增加仪表尺寸。
使用前，短暂旋转含有红玫瑰珠的存储管。使用切割移液器尖端，将每个免疫沉淀的珠浆的 100 微升转移到新的 1.7 毫升微离心管中。在每次转移之前旋转珠子，以防止珠子沉降，这一点很重要。
在17，500倍的重力和4摄氏度的离心管下离心一分钟。取出并丢弃上一液。通过添加 200 微升的 Lysis 缓冲液和短暂涡旋混合来重新填充珠子。
重复离心和洗涤珠子三次的过程。最后洗涤后，将珠子放在冰上，直到准备好继续。当样品孵育完成后，在17，500倍重力和4摄氏度的温度下离心3分钟。
然后，将每个样品的200微升转移到含有洗涤珠子的管子中。将管子放在四摄氏度的旋转器上一小时。接下来，在17，500倍的重力和4摄氏度的离心管下离心1分钟。
从每个上一液中去除 40 微升，以节省消耗控制。取出并丢弃上一液的剩余部分，小心不要打扰珠子。通过在每个样品中加入200微升的Lysis缓冲液来清洗样品，并短暂地旋转。
在17，500倍重力和4摄氏度的离心1分钟，丢弃上一代。重复此洗涤和离心过程三次，注意不打扰珠子。在此之后，向每个含有珠子的样品添加 50 微升 2X 样品缓冲液。
对于所有其他样本（包括输入控制、洗脱输入控件和损耗控制），添加 8 个 6X 样本缓冲区的微升。除含有珠子的管子外，每个管上下移液混合，并在 95 摄氏度下加热所有样品五分钟，然后继续使用 SDS-PAGE。要评估免疫沉淀是否成功，在单独的 12.5% 聚丙烯酰胺凝胶上运行从珠子中分离出的每个样品的 25 到 30 微升。
用库马西蓝染色每个凝胶，以可视化实验协议不同阶段的富集蛋白质。使用新的，干净的剃须刀刀片，小心切除任何独特的波段存在于激酶反应抗硫磷酸盐酯IP巷，同时记录其近似的分子量。每个独特的频带都应该使用新的剃须刀刀片。
该技术的基础是该技术是CK2使用GTP进行磷酸组转移的异常能力。将外源性CK2全息酶与GTP类似GTPPgamas添加到细胞落酸中，导致内源性CK2基质的硫磷化。随后用alkylating试剂p-Nitrobenzyl中酶酸酯随后处理这些特异性基质蛋白产生硫磷酸盐酯酸酯，然后使用抗硫磷酯酯抗体进行免疫沉淀，最终由质谱法鉴定。
在此显示的代表性阳性结果中，CK2 依赖性、硫磷化和随后的烷基化是成功的。不出所料，仅在含有完整激酶反应的车道上观察到西印的增强抗硫磷酯信号，而仅在GTPgammaS中观察到，PNMB只处理样品。免疫沉淀和暗示蛋白的库马西蓝色染色凝胶，也显示出积极的结果。
由于多个独特的波段仅在抗硫磷酸盐酯IP巷中可见，其中酸盐通过外源性CK2和GTPgamas孵育。标记带然后从凝胶中切除，并提交质谱仪进行蛋白质鉴定。按照此程序，必须通过附加方法（例如在标准体外激酶测定中通过 CK2 依赖磷酸化）验证质谱仪所识别的 CK2 基质基质。
