基于外膜囊泡显示SARS-CoV-2受体结合域的“即插即用”纳米颗粒疫苗平台

纳米科学在表面显示抗原后能有效增强抗原特异性免疫应答，该疫苗平台的主要优势是可以实现脱落斑块和显示。换句话说，该平台能够显示各种抗原的方法也可以应用于其他生物纳米颗粒，以显示引擎到纳米尺寸的载体。要进行溶细胞素 A 间谍导管转化，首先将 5 微升血浆溶液加入 50 微升 BL 21 感受态菌株中。

轻轻吹气，在冰上冷却 30 分钟。将溶液放入42摄氏度的水浴中90秒，然后立即将混合溶液放在冰上3分钟。向细菌悬浮液中加入500微升luria bertani培养基，并在37摄氏度下以每分钟220转的速度混合培养物一小时。

接下来，将所有含有氨苄青霉素的转化luria bertani琼脂平板在37摄氏度下培养过夜。对于OMV间谍捕手的生产，首先从平板中分离出单个菌落到20毫升luria bertani培养基中，并在37摄氏度下以每分钟220转的速度培养过夜。将细菌溶液孵育到两升培养基中，并在37摄氏度下以每分钟220转的速度培养5小时，直到达到对数生长阶段。

加入异丙基β D-IPTG，使细菌溶液的最终浓度为0.5毫摩尔，然后在25摄氏度下以每分钟220转的速度培养过夜。接下来，执行OMV间谍捕手纯化。从离心融合细菌溶液开始。

用0.22微米膜过滤器过滤上清液，然后使用中空纤维柱浓缩。通过0.22微米膜过滤器过滤浓缩物，然后使用超离心保险丝将其在4摄氏度下以150， 000倍G离心融合两小时，并用移液管丢弃上清液。用PBS重新悬浮沉淀，并将其储存在零下80摄氏度。

要进行RBD spytag转染，首先选择合适的真核表达系统，并在恢复后在37摄氏度下以每分钟130转的速度培养细胞过夜。将20微升HEK 293F细胞溶液加入自动细胞计数器中。记录细胞数，将浓度调整为1乘以10至每毫升6个细胞。

然后在37摄氏度下以每分钟130转的速度培养细胞4小时。通过0.22微米膜过滤器过滤RBD间谍标签质粒，并将300微克质粒加入细胞培养基中，直到最终体积为10毫升。摇晃 10 秒钟。

在水浴中将PEI加热至65摄氏度。将0.7毫升PEI与9.3毫升细胞培养基混合，间歇摇动10秒钟。将质粒溶液添加到PEI溶液中。

间歇性摇动混合物 10 秒钟，然后在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。将混合物加入280毫升细胞培养基中，并在37摄氏度下以每分钟130转的速度培养五天。接下来，执行 RBD 间谍标签纯化。

首先在25摄氏度下以6，000倍G离心融合细胞20分钟，然后使用移液管收集上清液。用两毫升镍NTA琼脂糖填充色谱柱，并用PBS洗涤三次。将咪唑加入细胞上清液中，使终浓度为20毫摩尔，并加载细胞上清液。

加入三柱体积的含有20毫摩尔咪唑的PBS进行洗涤，并收集洗涤级分。使用含有低至高浓度咪唑的三柱PBS进行梯度洗脱，每种浓度洗脱两次。为了通过BCA方法测定蛋白质浓度，将标准BSA蛋白质溶液从每毫升2稀释至0.0625毫克，将纯化的OMV间谍捕手和RBD间谍标签稀释10倍。

然后以50比1的比例混合BCA工作溶液A和B。加入稀释的蛋白质溶液，并与BCA工作溶液混合。在 37 度下孵育 30 分钟。

测量每个孔562纳米处的吸光度，并从标准曲线计算蛋白质浓度。要执行OMV间谍捕手和RBD间谍标签的生物偶联，请以40比1的比例混合OMV间谍捕手和RBD间谍标签和PBS。垂直旋转以在 4 摄氏度下以每分钟 15 转的速度将混合物混合过夜。

使用类似于OMV间谍捕手纯化的程序，使用PBS溶液对OMV RBD进行纯化。血浆设计方案表明，spycatcher基因通过柔性接头与cly A基因连接，而spytag通过hys标签基因连接到RBD基因的五个素末端进行纯化和验证。超速离心后，几乎所有未反应的RBD间谍标签都保留在上清液中。

与第一次相比，第二次超速离心没有提供进一步的显着优势。OMV捕手的z平均水动力直径为133纳米，而OMV-RBD的平均水动力直径为152.6纳米。这些差异可能是因为RBD在密集显示后增加了OMV粒径。

TEM的结果与DLS结果获得的粒度分布一致。用于混合混合物的旋转非常重要。在没有旋转的情况下，反应效率可以低得多。