已经建立了表面等离子体共振光谱，用于以中等通量方式测定蛋白质配体。提出了对同一分子结合位点变体的不同亲和力，即铁结合高方式低聚糖对病毒的亲和力。SPR是一种无标记技术，用于研究表面固定化受体的实时大分子结合。
在动力学分析中，多位点相互作用通过竞争性结合进行识别，而与大小无关 使用SPR的研究的特定领域是药物开发，以寻找抑制剂或抗体表征。动力学常数和亲和力直接从传感器响应中计算出来。首先，在LB-琼脂平板上转移100微升溶液，并使用无菌细胞扩散器轻轻涂抹。
使用多种浓度的双链DNA模板开始一系列样品反应，范围从5到50纳克，同时保持引物浓度恒定。然后在矿物油覆盖层下方添加DpnI限制性内切酶，并立即在37摄氏度下孵育一小时，以消化亲本超螺旋双链DNA。要解冻XL1-Blue超感受态细胞，请将细胞等分到预冷的小圆底管中。
接下来，从每个对照和样品反应中转移一微升DpnI处理的单链DNA，以分离合成互补链的超感受态细胞的等分试样。小心旋转转化反应混合后，将反应在冰上孵育30分钟。在42摄氏度下对转化反应施加热脉冲45秒，然后将反应放在冰上两分钟。
然后加入0.5毫升NZY+肉汤，在37摄氏度下孵育转化反应，以225至250RPM振荡一小时。之后，如前所述，将每个转化反应的正确体积铺在LB氨苄青霉素琼脂平板上。对于种子培养物，用转化板中的单个菌落接种少量含有LB的氨苄青霉素培养基。
使用过夜培养物，用包括10毫摩尔氯化镁，10毫摩尔硫酸镁和20毫摩尔葡萄糖在内的添加剂接种表达培养物，将种子培养物稀释至100倍。接下来，在 37 摄氏度下剧烈摇动培养细胞至 0.4 至 0.6 之间的吸收剂 600 纳米，然后将细胞冷却至 20 摄氏度并用一毫摩尔 IPTG 诱导并生长过夜。然后通过在4摄氏度下以4， 000g离心15分钟来收获细胞，并丢弃上清液。
将细胞沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水缓冲液中后，最近在4，000g下在4摄氏度下避难15分钟。然后用移液管弃去上清液。接下来，将剩余的沉淀重悬于10毫升裂解缓冲液中，并将悬浮液在37摄氏度下孵育一小时。
然后在4摄氏度下以4， 000g离心15分钟来分离可溶性和不溶性级分。此外，在 14 毫升管中使用 HIS-Select Ni2+亲和凝胶，分别用 20 毫摩尔咪唑和 250 毫摩尔咪唑将其标记的重组表达的氰基蛋白-N 结合并重悬于缓冲溶液中。在这些步骤之间分批孵育至少 30 分钟。
加入含有250毫摩尔咪唑的洗脱缓冲液以洗脱蛋白质。将蛋白质溶液转移到带有10千克道尔顿截止过滤器的离心管中，并通过在4，500g和4摄氏度下离心10分钟来浓缩它们。将SPR电泳缓冲液加入1至10的稀释因子，并在4，500g和4摄氏度下将4次离心至初始体积10分钟。
然后，使用NanoDrop紫外可见分光光度计确定280纳米处的蛋白质浓度，该消光系数基于主要蛋白质CVN2L0的计算消光系数，显示大小为23， 474道尔顿。对于双通道SPR系统，使用HBSCP plus作为电泳缓冲液，pH 1.5至1.6的10毫摩尔甘氨酸盐酸作为再生缓冲液，并打开仪器脱气器，自动进样器和泵。然后用双蒸水清洗整个系统一小时。
接下来，将浸油滴到探测器上，并安装涂有薄金膜的玻璃传感器芯片。而在上侧，用羧甲基葡聚糖水凝胶功能化后直接到三端口流通池下方的检测器上。然后通过下拉手柄来修复设置。
要将蛋白质配体固定到传感器芯片上，请单击菜单栏中的“表格”打开运行表，然后在集成的SPP自动链接软件中运行表编辑器。然后从可用运行表列表中选择并单击基本固定，并按照计算机屏幕上的实验程序步骤进行操作。接下来，单击表单部分中的样品集编辑器，填写放置在自动进样器中的两个架子的试剂列表，以便进一步分析。
单击菜单栏中的自动进样器直接控制作为工具，将样品架向前或带回原位，并选择 4 摄氏度作为工作温度。启动泵，通过单击工具和泵直接控制注入双蒸水。并通过单击SPR仪器直接控制来记录数据。
每次，从新出现的窗口开始。将偶联试剂添加到 300 μL 小瓶中后，将它们放入自动进样器架中，然后单击 Run 启动运行表。对于简单的蛋白质 - 蛋白质相互作用，以每分钟25， 000微升的速度重新填充泵后，进行基线调整30秒。
允许随后用双蒸水进行基线调整 1.5 分钟，然后用一摩尔乙醇胺盐酸盐（pH 8.5）淬灭活化的芯片表面。然后使用HBS-EP+将管子从液体采样器切换到脱气器，从双蒸水切换到瓶中，单击表单，向下滚动，然后单击此操作模式更改为后处理。然后单击“添加”（Add），为每个流通池选择数据平台中随时间推移生成的结合曲线，并将叠加层导出为洗涤器文件。
接下来，单击“文件”以打开文件保存选项，并通过对齐左右曲线并从配体通道的信号中减去第二个参考通道的信号来获得响应曲线。首先测试CVN2L0和方差V2和V5的单次进样是否与血凝素偶联传感器芯片结合，以使用自动进样器和运行表编辑器估计结合能力。随着时间的推移，在系统中以纳摩尔和微摩尔范围内的各种浓度自动重复进样，证明芯片表面没有达到饱和度或平衡结合。
假设 RBD S1 亚基上可能保守的碳水化合物具有较弱的亲和力，解离速率常数为 260 μmol，则绘制 CVN 野生型与 RBD 结合的浓度与反应的关系图。CVN2L0-V4与DM结合的相同亲和力图不再可分析，因为二硫化物键的替换干扰了与小糖基化肽的高亲和力结合，并产生高于响应最大值的响应。CVN在SARS-CoV-2上与RBD的野生型结合显示出与S蛋白和RBD的结合，解离狂暴常数分别为18.6微摩尔和260微摩尔。
尽管分析物浓度的SPR响应导致CVN野生型和E41A结合的高响应单元和典型的SPR传感器图。然而，突变体在稀释时不稳定。SPR生物传感正在解决纯化蛋白质及其变体与配体的高亲和力和低亲和力结合问题。
在我们的例子中，糖蛋白利用光学读数和传感器芯片表面上的双通道流动系统。酶作为免疫吸附测定是一种替代免疫学方法，可识别蛋白质表位，但也提供复杂基质中肽和小分子浓度的数据。通过SPR结合测定测试重组表达的蛋白质，结合确认变化的生物传感，这对于通过计算蛋白质侧验证和预测蛋白质稳定性很有用。
