나노 과학은 표면에 항원을 표시 한 후 항원 특이 적 면역 반응을 효과적으로 향상시킬 수 있습니다.이 백신 플랫폼의 주요 장점은 플라크 및 디스플레이를 제거 할 수 있습니다. 즉, 플랫폼에서 다양한 항원을 표시할 수 있게 되어 이 방법은 나노크기의 담체에 다른 생체 나노입자를 디스플레이엔진으로 적용할 수도 있다. cytolysin A 스파이 카테터 변형을 수행하려면 50 마이크로 리터의 BL 21 적격 균주에 5 마이크로 리터의 혈장 용액을 첨가하는 것으로 시작하십시오.
부드럽게 불어서 얼음에서 30 분 동안 식히십시오. 섭씨 42 도의 수조에 90 초 동안 용액을 넣은 다음 즉시 혼합 용액을 얼음에 3 분 동안 두십시오. 500 마이크로리터의 루리아 베르타니 배지를 박테리아 현탁액에 첨가하고, 혼합 배양 후 섭씨 37도에서 분당 220회전으로 1시간 동안 배양한다.
다음으로, 암피실린을 함유하는 모든 형질전환루리아 베르타니 한천 플레이트를 섭씨 37도에서 밤새 배양하였다. OMV 스파이캐처 생산의 경우, 플레이트에서 단일 콜로니를 20밀리리터의 루리아 베르타니 배지로 분리하고 섭씨 37도에서 분당 220회전으로 밤새 배양하는 것으로 시작합니다. 박테리아 용액을 2리터 배지에 넣고 대수 성장 단계에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 분당 220회전으로 5시간 동안 배양합니다.
이소프로필 베타 D-IPTG를 첨가하여 박테리아 용액의 최종 농도를 0.5밀리몰로 만든 다음 섭씨 25도에서 분당 220회전으로 밤새 배양합니다. 다음으로 OMV 스파이 캐처 정제를 수행하십시오. 박테리아 용액을 융합하는 센트리로 시작하십시오.
0.22 마이크로 미터 멤브레인 필터로 상청액을 여과 한 다음 중공 섬유 컬럼을 사용하여 농축하십시오. 농축액을 0.22 마이크로 미터 멤브레인 필터를 통해 여과 한 다음 초 센트리 퓨즈를 사용하여 섭씨 4도에서 2 시간 동안 섭씨 150, 000 배 G에서 센트리 융합하고 피펫으로 상층액을 버립니다. PBS로 강수량을 다시 현탁하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.
RBD 스파이태그 형질감염을 수행하려면 적절한 진핵생물 발현 시스템을 선택하는 것으로 시작하여 회복 후 섭씨 37도에서 분당 130회전으로 밤새 세포를 배양합니다. 20마이크로리터 HEK 293F의 세포 용액을 자동 세포 카운터에 추가합니다. 세포의 수를 기록하고, 밀리리터당 6개의 세포에 10배로 농도를 조절한다.
그런 다음 세포를 섭씨 37도에서 분당 130회전으로 4시간 동안 배양합니다. 0.22 마이크로미터 멤브레인 필터를 통해 RBD 스파이 태그 플라스미드를 여과하고 최종 부피가 10밀리리터가 될 때까지 300마이크로그램의 플라스미드를 세포 배양 배지에 추가합니다. 10 초 동안 흔들어주십시오.
수조에서 PEI를 섭씨 65도까지 가열합니다. 0.7 밀리리터의 PEI와 9.3 밀리리터의 세포 배양 배지를 혼합하고 10 초 동안 간헐적으로 흔든다. PEI 용액에 플라스미드 용액을 첨가한다.
혼합물을 10초 동안 간헐적으로 흔들고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 혼합물을 280 밀리리터의 세포 배양 배지에 첨가하고, 5일 동안 섭씨 37도에서 분당 130회전으로 배양한다. 다음으로 RBD 스파이 태그 정제를 수행하십시오.
섭씨 25도에서 20 분 동안 6, 000 배 G에서 세포를 융합하는 중심에서 시작하고 피펫을 사용하여 상층액을 수집합니다. 컬럼에 2 밀리리터의 니켈 NTA 아가 로스를 채우고 PBS로 3 회 세척하십시오. 이미다졸을 세포 상청액에 첨가하여 최종 농도가 20밀리몰이 되도록 하고 세포 상청액을 적재합니다.
세척을 위해 20 밀리몰의 이미다졸을 함유하는 PBS의 3개의 컬럼 부피를 첨가하고, 세척 분획을 수집한다. 저농도에서 고농도의 이미다졸을 함유하는 PBS의 3열 부피로 그래디언트 용리를 각 농도에 대해 2회 용리한다. BCA 방법으로 단백질 농도를 측정하려면 표준 BSA 단백질 용액을 밀리리터당 2에서 0.0625 밀리그램으로 연속 희석하고 정제된 OMV 스파이캐처 및 RBD 스파이 태그를 10배 희석합니다.
그런 다음 BCA 작업 용액 A와 B를 50 대 1의 비율로 혼합하십시오. 희석 된 단백질 용액을 첨가하고 BCA 작업 용액과 혼합하십시오. 37도에서 30 분 동안 배양하십시오.
각 웰의 562 나노미터에서 흡광도를 측정하고, 표준곡선으로부터 단백질 농도를 계산한다. OMV 스파이캐처와 RBD 스파이 태그의 생체 접합을 수행하려면 OMV 스파이캐처와 RBD 스파이태그 및 PBS를 40:1 비율로 혼합합니다. 수직으로 회전하여 섭씨 4도에서 분당 15회전으로 혼합물을 밤새 혼합합니다.
OMV 스파이캐처 정제와 유사한 절차를 사용하여 PBS 용액을 사용하여 OMV RBD의 정제를 수행합니다. 혈장 설계 방식은 스파이캐처 유전자가 유연한 링커를 통해 cly A 유전자와 연결되는 반면 스파이태그는 정제 및 검증을 위해 hys 태그 유전자로 RBD 유전자의 5개 프라임 말단에 연결됨을 보여줍니다. 초원심분리 후, 거의 모든 반응하지 않은 RBD 스파이태그가 상청액에 남아있었다.
두 번째 초원심분리는 첫 번째에 비해 더 유의한 이점을 제공하지 않았습니다. OMV 스파이캐처의 z 평균 유체역학적 직경은 133나노미터인 반면 OMV-RBD의 경우 152.6나노미터였습니다. 이러한 차이는 RBD가 집중 표시 후 OMV 입자 크기를 증가시키기 때문일 수 있습니다.
TEM의 결과는 DLS 결과로부터 수득된 입자 크기 분포와 일치한다. 혼합물을 혼합하기위한 회전은 매우 중요합니다. 반응 효율은 회전없이 훨씬 낮을 수 있습니다.
