ナノサイエンスは、表面に抗原を表示した後、抗原特異的免疫応答を効果的に強化することができます このワクチンプラットフォームの主な利点は、プラークとディスプレイのゴーオフを達成することができます。換言すれば、プラットフォームは、この方法において様々な抗原を表示することができ、他の生物学的ナノ粒子にも適用してエンジンをナノサイズの担体に表示することができる。サイトライシンAスパイカテーテル変換を実行するには、50マイクロリットルのBL 21コンピテント株に5マイクロリットルの血漿溶液を加えることから始めます。
静かに吹き、氷上で30分間冷まします。溶液を摂氏42度の水浴に90秒間置き、次に混合溶液を氷上に3分間置く。500マイクロリットルのルリアベルターニ培地を細菌懸濁液に加え、毎分220回転で摂氏37度で1時間混合培養した後。
次に、アンピシリンを含む形質転換ルリア・ベルタニ寒天プレートを全てプレートし、摂氏37度で一晩培養した。OMVスパイキャッチャーの生産では、プレートから単一のコロニーを20ミリリットルのルリアベルターニ培地に分離し、摂氏37度で毎分220回転で一晩培養することから始めます。細菌溶液を2リットルの培地にインキュベートし、摂氏37度で毎分220回転で対数増殖段階に達するまで5時間培養します。
イソプロピルベータD-IPTGを加えて細菌溶液の最終濃度を0.5ミリモルにし、摂氏25度で毎分220回転で一晩培養します。次に、OMVスパイキャッチャーの精製を実行します。細菌溶液を遠心分離して融合することから始めます。
上清を0.22マイクロメートルのメンブレンフィルターでろ過し、中空糸カラムを使用して濃縮します。濃縮液を0.22マイクロメートルのメンブレンフィルターでろ過し、超遠心ヒューズを使用して摂氏4度で2時間、150, 000倍Gで遠心融合し、ピペットで上清を廃棄します。沈殿をPBSで再懸濁し、摂氏マイナス80度で保存します。
RBD spytagトランスフェクションを実行するには、適切な真核生物発現系を選択することから始め、回収後、細胞を摂氏37度で毎分130回転で一晩培養します。20マイクロリットルのHEK 293Fセル溶液を自動セルカウンターに追加します。細胞数を記録し、濃度を1ミリリットルあたり10〜6細胞に1倍に調整する。
そして、細胞を摂氏37度で毎分130回転で4時間培養します。RBDスパイタグプラスミドを0.22マイクロメートルのメンブレンフィルターでろ過し、最終容量が10ミリリットルになるまで300マイクログラムのプラスミドを細胞培養培地に加えます。10秒間振とうします。
PEIを水浴中で摂氏65度に加熱する。0.7ミリリットルのPEIと9.3ミリリットルの細胞培養培地を混合し、10秒間断続的に振とうします。プラスミド溶液をPEI溶液に加える。
混合物を10秒間断続的に振とうし、摂氏37度で15分間インキュベートします。この混合物を280ミリリットルの細胞培養培地に加え、摂氏37度で毎分130回転で5日間培養する。次に、RBDスパイタグの精製を実行します。
摂氏25度で20分間、6, 000倍Gで細胞を遠心分離して融合させ、ピペットを使用して上清を収集します。カラムに2ミリリットルのニッケルNTAアガロースを入れ、PBSで3回洗浄します。細胞上清にイミダゾールを加えて最終濃度を20ミリモルにし、細胞上清をロードします。
洗浄のために20ミリモルのイミダゾールを含むPBSを3カラム容量加え、洗浄画分を回収する。低濃度から高濃度のイミダゾールを含む3カラム容量のPBSによるグラジエント溶出は、各濃度に対して2回溶出します。BCA法によってタンパク質濃度を決定するには、標準BSAタンパク質溶液をミリリットルあたり2〜0.0625ミリグラムに連続的に希釈し、精製されたOMVスパイキャッチャーとRBDスパイタグを10倍に希釈します。
次に、BCA作業溶液AとBを50対1の比率で混合します。希釈したタンパク質溶液を加え、BCA作業溶液と混合します。37度で30分間インキュベートします。
各ウェルの562ナノメートルの吸光度を測定し、検量線からタンパク質濃度を算出する。OMVスパイキャッチャーとRBDスパイタグのバイオコンジュゲーションを実行するには、OMVスパイキャッチャーとRBDスパイタグとPBSを40対1の比率で混合します。垂直回転させて、摂氏4度で毎分15回転で一晩混合物をブレンドします。
OMVスパイキャッチャー精製と同様の手順を使用して、PBS溶液を使用してOMV RBDの精製を実行します。血漿設計スキームは、スパイキャッチャー遺伝子がフレキシブルリンカーを介してcly A遺伝子に接続され、スパイタグが精製および検証のためにhysタグ遺伝子でRBD遺伝子の5つのプライム末端に接続することを示しています。超遠心後、ほとんどすべての未反応RBDスパイタグが上清に残った。
2回目の超遠心分離は、1回目に比べてさらに大きな利点を提供しませんでした。OMVスパイキャッチャーのz平均流体力学的直径は133ナノメートルでしたが、OMV-RBDは152.6ナノメートルでした。これらの違いは、RBDが集中的な表示後にOMV粒子サイズを増加させるためである可能性があります。
TEMの結果は、DLSの結果から得られた粒度分布と一致している。混合物をブレンドするための回転は非常に重要です。反応効率は回転なしでははるかに低くなる可能性があります。
