使用氧化氘定量测定棕色脂肪组织中 从头 脂肪酸合成

与葡萄糖处理等其他代谢途径相反，脂肪酸合成没有常规评估，导致对代谢状态的解释不完整。这种方法的主要优点是它相对非侵入性，并且与使用同位素标记的葡萄糖相比，它可能更好地反映脂肪酸合成通量，因为上游葡萄糖处理的变化会影响结果。在这里，我们专注于棕色脂肪组织，但这种方法对于研究任何小鼠模型中的任何组织都有潜在用处。

首先，将样品放在干冰上。取一个预先标记的微量离心管，将其放在分析天平上并去皮。然后将镊子和手术刀或钢制剃须刀片放在干冰上 10 到 20 秒冷却。

使用镊子将冷冻组织样品从试管中取出，并将其放在塑料配重船上，该配重舟可以放置在平坦的干冰块或其他预冷的表面上。使用手术刀或钢制剃须刀片，解剖相当于 5 至 15 毫克重量的一小部分组织，并将其放入微量离心管中。记录每个试样的确切重量并重复。

每毫克加入 1 微升 10 毫摩尔十六烷酸 D31 酸，然后向每个样品中加入三个 5 毫米的不锈钢珠。然后向每个带有珠子的样品中加入 250 微升甲醇、250 微升水和 500 微升氯仿。将试管放入研磨机的预冷块中，并以 25 赫兹的振动频率混合样品五分钟。

使用磁铁取出珠子，并将样品在4摄氏度下以12,000G离心10分钟。使用微量移液器，将固定体积的每个样品的底部相放入相应标记的微量离心管中。向剩余样品中加入 500 微升氯仿，然后重复这些步骤。

将具有组合下相的试管置于氮气下或耐氯仿的冷冻离心真空中，温度为4摄氏度，直至完全干燥。将 98 毫升无水甲醇移液到玻璃培养基瓶中。并在通风橱中缓慢加入两毫升无水硫酸，制成2%硫酸的甲醇溶液。

通过旋转封闭的瓶子进行混合。向每个样品中加入 500 微升这种 2% 硫酸的甲醇溶液并短暂涡旋。将样品在 50 摄氏度的加热块上孵育两小时，并向每个样品中加入 100 微升饱和氯化钠溶液和 500 微升己烷。

在室温下将样品剧烈涡旋一分钟，然后让样品静置一分钟。在此之后，这两个阶段应该很明显。将上层相收集到新鲜的微量离心管中。

然后重复添加己烷。相分离后，将第二个上相样品收集到相同的标记管中。在室温下在氮气下干燥样品，并将样品重悬于每毫克原始组织重量20微升己烷中。

立即将样品转移到带有玻璃插件的玻璃气相色谱小瓶中。将样品注入单个四联气相色谱质谱仪中，以确定脂肪酸甲酯或FAME同位素异构体的丰度。使用氦气作为载气，在入口温度为 270 摄氏度的情况下将一微升样品注入分流或不分流入口。

在标记的安全锁微量离心管中，将每个血浆样品混合 10 微升或标准 4 微升 10 摩尔氢氧化钠和 4 微升 5% 丙酮的乙腈溶液。对每个样品一式三份。将样品在室温下孵育过夜后，向每个样品中加入 450 至 550 毫克硫酸钠，在通风橱中的每根管中加入 600 微升氯仿，并剧烈涡旋 15 秒。

将样品以300G离心两分钟。取带有玻璃插件的标记玻璃GCMS小瓶，将一式三份，然后从每个样品中转移80微升等分试样的上清液到小瓶中。盖紧小瓶盖以进行GCMS分析。

此处显示了多个时间点小鼠血浆中D2O富集的百分比。结果发现，体内水分的富集度在2.5%至6%的范围内，体内水中氘的富集基线水平在一小时内迅速达到，并在研究期间保持。此处显示了在室温和热中性条件下 D2O 给药三天后棕榈酸酯在棕色脂肪组织中的质量同位素分布。

该结果表明，室温下 M1 和 M2 氘富集较高。该图显示了在室温下D2O给药三天后一系列脂肪酸的棕色脂肪组织摩尔富集和血浆摩尔富集和热中性。在棕色脂肪组织中的多种脂肪酸中发现了较冷的温度富集。

值得注意的是，血浆总脂肪酸富集与棕色脂肪组织不同，而是随着热中性而增加脂肪酸富集。这些图像代表了 D2O 给药三天后棕色脂肪组织中的总丰度和从头合成的棕榈酸酯。结果表明，在室温下，棕榈酸酯的总合成量有所增加。

在GCMS上运行脂肪酸时要小心。确保棕榈酸酯不会超载，因为会人为地提供高同位素富集值。此外，在GCMS上分析丙酮时，请确保在运行样品之前没有背景丙酮峰，因此请运行空白以去除系统中的任何丙酮。

这种方法着眼于多个脂质类别的总脂肪酸，但如果您想了解脂肪酸合成如何影响特定的脂质类别，您可以首先使用色谱法分离这些脂质类别，然后从这些馏分中提取脂肪酸。由于脂肪生成是正常发育的关键因素，也是许多疾病的关键因素，因此该方案在许多领域都很有用。