Ao contrário de outras vias metabólicas, como o descarte de glicose, a síntese de ácidos graxos não é rotineiramente avaliada, levando a interpretações incompletas do estado metabólico. Os principais benefícios deste método é que ele é relativamente não invasivo, e é provavelmente um reflexo melhor do fluxo de síntese de ácidos graxos do que o uso de glicose marcada com isótopos, onde mudanças na manipulação de glicose a montante podem afetar os resultados. Aqui, nos concentramos no tecido adiposo marrom, mas este método é potencialmente útil para estudar qualquer tecido em qualquer modelo de camundongo.
Para começar, coloque as amostras em gelo seco. Pegue um tubo de microcentrífuga pré-marcado, coloque-o em uma balança analítica e amarre a balança. Em seguida, coloque uma pinça e um bisturi ou lâmina de barbear de aço sobre gelo seco por 10 a 20 segundos para esfriar.
Use a pinça para retirar a amostra de tecido congelado do tubo e colocá-la em um barco de peso plástico, que pode ser posicionado em um bloco plano de gelo seco ou outra superfície pré-resfriada. Usando o bisturi ou lâmina de barbear de aço, disseque uma pequena porção do tecido equivalente a 5 a 15 miligramas de peso e coloque-o no tubo de microcentrífuga. Registre o peso exato e repita para cada amostra.
Adicionar um microlitro por miligrama de ácido hexadecanóico D31 de 10 milimolares seguido de três esferas de aço inoxidável de cinco milímetros a cada amostra. Em seguida, adicione 250 microlitros de metanol, 250 microlitros de água e 500 microlitros de clorofórmio a cada amostra com miçangas. Coloque os tubos num bloco pré-arrefecido de um moinho e misture as amostras a uma frequência vibracional de 25 hertz durante cinco minutos.
Retire as contas usando um ímã e centrifugar as amostras a 12.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Usando uma micropipeta, pegue um volume fixo da fase inferior de cada amostra em tubos de microcentrífuga correspondentemente marcados. Adicione 500 microlitros de clorofórmio à amostra restante e repita estes passos.
Coloque os tubos com a fase inferior combinada sob gás nitrogênio ou em um vácuo centrífugo refrigerado resistente ao clorofórmio a quatro graus Celsius até secar completamente. Pipetar 98 mililitros de metanol anidro para uma garrafa de meio de vidro. E adicione lentamente dois mililitros de ácido sulfúrico anidro no exaustor para fazer 2% de ácido sulfúrico em metanol.
Misture girando o frasco fechado. Adicione 500 microlitros deste ácido sulfúrico a 2% em solução de metanol a cada amostra e volte brevemente. Incubar as amostras no bloco térmico a 50 graus Celsius durante duas horas e adicionar 100 microlitros de solução saturada de cloreto de sódio e 500 microlitros de hexano a cada amostra.
Vórtice as amostras vigorosamente à temperatura ambiente durante um minuto e deixe as amostras sentar-se durante um minuto. As duas fases devem ser aparentes depois disso. Recolha a fase superior num tubo de microcentrífuga fresco.
Em seguida, repita a adição de hexano. E após a separação de fases, colete as amostras da segunda fase superior nos mesmos tubos marcados. Secar as amostras à temperatura ambiente sob gás nitrogênio e ressuspender as amostras em 20 microlitros de hexano por miligrama de peso do tecido original.
Transfira imediatamente as amostras para um frasco para injetáveis de cromatografia gasosa de vidro com uma pastilha de vidro. Injectar as amostras num único espectrómetro de massas por cromatografia gasosa quádrupla para determinar a abundância de ésteres metílicos de ácidos gordos ou isotopólogos FAME. Injete um microlitro de amostra em uma entrada dividida ou sem divisão a uma temperatura de entrada de 270 graus Celsius usando hélio como gás transportador.
Em tubos de microcentrífuga marcados, combinar 10 microlitros de cada amostra de plasma ou quatro microlitros padrão de hidróxido de sódio 10 molar e quatro microlitros de acetona 5% em acetonitrila. Execute isso em triplicata para cada amostra. Depois de incubar as amostras durante a noite à temperatura ambiente, adicione 450 a 550 miligramas de sulfato de sódio a cada amostra, adicione 600 microlitros de clorofórmio a cada tubo no exaustor e agite vigorosamente durante 15 segundos.
Centrifugar as amostras a 300 G durante dois minutos. Pegue frascos de vidro rotulados com pastilhas de vidro e transfira a triplicata e, em seguida, alíquotas de 80 microlitros do sobrenadante de cada amostra para os frascos. Tampe bem os frascos para a análise do GCMS.
A porcentagem de enriquecimento de D2O no plasma de camundongos em vários pontos de tempo é mostrada aqui. Verificou-se que a água corporal é enriquecida na faixa de 2,5 a 6% que um nível basal de enriquecimento de deutério na água corporal é rapidamente alcançado em uma hora e mantido durante o estudo. A distribuição isotopológica de massa do palmitato no tecido adiposo marrom após três dias de administração de D2O à temperatura ambiente e termoneutralidade é mostrada aqui.
Este resultado mostra um maior enriquecimento de deutério M1 e M2 à temperatura ambiente. O enriquecimento molar do tecido adiposo marrom e o enriquecimento molar plasmático de uma variedade de ácidos graxos após três dias de administração de D2O à temperatura ambiente e termoneutralidade são apresentados nesta figura. O enriquecimento com temperatura mais fria foi encontrado em uma ampla gama de ácidos graxos no tecido adiposo marrom.
Notavelmente, o enriquecimento de ácidos graxos totais plasmáticos não segue a mesma tendência que o tecido adiposo marrom, mas em vez disso, o enriquecimento de ácidos graxos é aumentado com termoneutralidade. Estas imagens representam a abundância total e o palmitato sintetizado de novo no tecido adiposo marrom após três dias da administração de D2O. O resultado mostra um aumento na síntese total de palmitato à temperatura ambiente.
Tenha cuidado ao executar ácidos graxos no GCMS. Certifique-se de que o palmitato não está sobrecarregado, pois apenas pode dar valores de enriquecimento de isótopos artificialmente altos. Além disso, ao analisar a acetona no GCMS, certifique-se de que não há nenhum pico de acetona de fundo antes de executar as amostras, portanto, execute espaços em branco para remover qualquer acetona no sistema.
Este método analisa os ácidos graxos totais em várias classes lipídicas, mas se você quiser entender como a síntese de ácidos graxos está impactando classes lipídicas específicas, você pode primeiro separar essas classes lipídicas usando cromatografia e, em seguida, extrair ácidos graxos dessas frações. Como a lipogênese é um contribuinte chave para o desenvolvimento normal, mas também para muitas doenças, este protocolo pode ser útil em muitos campos.
