A diferencia de otras vías metabólicas como la eliminación de glucosa, la síntesis de ácidos grasos no se evalúa de forma rutinaria, lo que lleva a interpretaciones incompletas del estado metabólico. Los beneficios clave de este método es que es relativamente no invasivo, y es probable que refleje mejor el flujo de síntesis de ácidos grasos que el uso de glucosa marcada con isótopos, donde los cambios en el manejo de la glucosa aguas arriba pueden afectar los resultados. Aquí, nos centramos en el tejido adiposo marrón, pero este método es potencialmente útil para estudiar cualquier tejido en cualquier modelo de ratón.
Para comenzar, coloque las muestras en hielo seco. Tome un tubo de microcentrífuga preetiquetado, colóquelo en una balanza analítica y tara la balanza. Luego coloque unas pinzas y un bisturí o una hoja de afeitar de acero sobre hielo seco durante 10 a 20 segundos para que se enfríe.
Use las pinzas para sacar la muestra de tejido congelado del tubo y colóquela en un bote de pesas de plástico, que se puede colocar sobre un bloque plano de hielo seco u otra superficie preenfriada. Con el bisturí o la hoja de afeitar de acero, diseccione una pequeña porción del tejido equivalente a 5 a 15 miligramos de peso y colóquela en el tubo de microcentrífuga. Registre el peso exacto y repita para cada espécimen.
Agregue un microlitro por miligramo de ácido D31 hexadecanoico de 10 milimolares, seguido de tres perlas de acero inoxidable de cinco milímetros a cada muestra. Luego agregue 250 microlitros de metanol, 250 microlitros de agua y 500 microlitros de cloroformo a cada muestra con perlas. Coloque los tubos en un bloque preenfriado de un molino de molienda y mezcle las muestras a una frecuencia vibratoria de 25 hercios durante cinco minutos.
Retire las perlas con un imán y centrifugue las muestras a 12.000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Con una micropipeta, tome un volumen fijo de la fase inferior de cada muestra en tubos de microcentrífuga marcados correspondientemente. Agregue 500 microlitros de cloroformo a la muestra restante y repita estos pasos.
Coloque los tubos con la fase inferior combinada bajo gas nitrógeno o en un vacío centrífugo refrigerado resistente al cloroformo a cuatro grados centígrados hasta que estén completamente secos. Pipetear 98 mililitros de metanol anhidro en una botella de vidrio. Y agregue lentamente dos mililitros de ácido sulfúrico anhidro en la campana extractora para hacer ácido sulfúrico al 2% en metanol.
Mezcle girando la botella cerrada. Agregue 500 microlitros de esta solución de ácido sulfúrico al 2% en metanol a cada muestra y vórtice brevemente. Incubar las muestras en el bloque térmico a 50 grados centígrados durante dos horas y añadir 100 microlitros de solución saturada de cloruro de sodio y 500 microlitros de hexano a cada muestra.
Agite vigorosamente las muestras a temperatura ambiente durante un minuto y déjelas reposar durante un minuto. Las dos fases deberían ser evidentes después de esto. Recoja la fase superior en un tubo de microcentrífuga nuevo.
Luego repita la adición de hexano. Y después de la separación de fases, recoja las muestras de la segunda fase superior en los mismos tubos etiquetados. Secar las muestras a temperatura ambiente bajo gas nitrógeno y volver a suspender las muestras en 20 microlitros de hexano por miligramo de peso original del tejido.
Transfiera las muestras inmediatamente a un vial de cromatografía de gases de vidrio con un inserto de vidrio. Inyecte las muestras en un único espectrómetro de masas de cromatografía cuádruple de gases para determinar la abundancia de ésteres metílicos de ácidos grasos o isótopos FAME. Inyecte un microlitro de muestra en una entrada dividida o sin división a una temperatura de entrada de 270 grados Celsius utilizando helio como gas portador.
En tubos de microcentrífuga con cierre seguro etiquetados, combine 10 microlitros de cada muestra de plasma o cuatro microlitros estándar de hidróxido de sodio 10 molar y cuatro microlitros de acetona al 5% en acetonitrilo. Realice esto por triplicado para cada muestra. Después de incubar las muestras durante la noche a temperatura ambiente, agregue de 450 a 550 miligramos de sulfato de sodio a cada muestra, agregue 600 microlitros de cloroformo a cada tubo en la campana extractora y haga un vórtice vigoroso durante 15 segundos.
Centrifugar las muestras a 300 G durante dos minutos. Tome viales de vidrio etiquetados con GCMS con insertos de vidrio y transfiera el triplicado y luego 80 alícuotas de microlitros del sobrenadante de cada muestra a los viales. Tape bien los viales para el análisis GCMS.
Aquí se muestra el porcentaje de enriquecimiento de D2O en el plasma de ratones en múltiples puntos de tiempo. Se encontró que el agua corporal está enriquecida en el rango de 2.5 a 6%que un nivel de referencia de enriquecimiento de deuterio en el agua corporal se alcanza rápidamente en una hora y se mantiene durante la duración del estudio. Aquí se muestra la distribución isotópica masiva del palmitato en el tejido adiposo marrón después de tres días de administración de D2O a temperatura ambiente y termoneutralidad.
Este resultado muestra un mayor enriquecimiento de deuterio M1 y M2 a temperatura ambiente. En esta figura se presenta el enriquecimiento molar del tejido adiposo marrón y el enriquecimiento molar plasmático de una serie de ácidos grasos después de tres días de administración de D2O a temperatura ambiente y termoneutralidad. El enriquecimiento de temperatura más fría se encontró en una amplia gama de ácidos grasos en el tejido adiposo marrón.
En particular, el enriquecimiento de ácidos grasos totales en plasma no sigue la misma tendencia que el tejido adiposo marrón, sino que el enriquecimiento de ácidos grasos aumenta con la termoneutralidad. Estas imágenes representan la abundancia total y el palmitato sintetizado de novo en el tejido adiposo marrón después de tres días de administración de D2O. El resultado muestra un aumento en la síntesis total de palmitato a temperatura ambiente.
Tenga cuidado al ejecutar ácidos grasos en el GCMS. Asegúrese de que el palmitato no esté sobrecargado, ya que puede dar valores de enriquecimiento de isótopos artificialmente altos. Además, cuando analice la acetona en el GCMS, asegúrese de que no haya un pico de acetona de fondo antes de ejecutar las muestras, así que ejecute espacios en blanco para eliminar la acetona del sistema.
Este método analiza los ácidos grasos totales en múltiples clases de lípidos, pero si desea comprender cómo la síntesis de ácidos grasos afecta a clases específicas de lípidos, primero puede separar estas clases de lípidos mediante cromatografía y luego extraer los ácidos grasos de estas fracciones. Debido a que la lipogénesis es un factor clave para el desarrollo normal, pero también para muchas enfermedades, este protocolo puede ser útil en muchos campos.
